磺化多糖抑制人免疫缺陷病毒的研究进展

　　 摘　要　目的：观察栀子西红花甙对Beagle犬的各种毒性反应，以评价栀子西红花甙的安全性。方法：栀子西红花甙以0、50、112、250 mg/kg每天静脉注射给药一次，每周6 d，连续给药13周。结果：静脉注射栀子西红花甙后，犬主要表现为皮肤搔痒，皮肤、粘膜、巩膜等染成黄色，尿液、粪便颜色加深，且总胆红素和白细胞显著升高，而红细胞计数、血红蛋白及红细胞压积明显降低，活动减少等。对犬的血清生化、尿、粪常规、体重增长、心电图等均未发现明显的与药物作用有关的异常变化。组织切片检查表明，在所有受检脏器中，均未见明显的病理改变。结论：在此试验条件下，栀子西红花甙静脉注射给药13周对犬的无毒剂量为50 mg/kg。

　　中图分类号　R282.71

Thirteen-week Veinal Toxicity Study of Crocins in Beagle Dogs

Zhang Luyong, Jiang Zhenzhou, Cao Yuping, Zhao Xiaochen

　　（Xinzhong New Drug Screening Center, China Pharmaceutical University，Nanjing 210009)

　　Abstract　Purpose:The toxicity study of crocins, which were isolated from the fruits of Gardenia jasminoides Ellis, was conducted in beagle dogs to evaluate its safety. Methods: The 13-week repeated doses of 0, 50, 112, 250 mg/kg were injected intravenously once daily. Results: No deaths occurred in any group. As main clinical signs or changes due to the drug treatment, cutaneous pruritus, yellowed skin, mucosa, sclera, increased TBIL and WBA, decreased RBC, HGB, HCT, and reduced locomotor activity were noted in the 250 mg/kg dose group. There were no drug-related changes in food intake, urinalysis, fecal occult blood test, body weight, electrocardiogram, blood chemistry, hepatic and renal function tests, organ weight and autopsy. Conclusion: From these results, the non-toxic dose of crocins was estimated to be 50 mg/kg under the present conditions.

　　Key words　Crocins, Toxicity, Beagle dogs, IV injection

　　栀子为茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的果实，具有泻火解毒、清热利尿、凉血解毒等作用［1, 2］。栀子西红花总甙（Crocins）是从栀子成熟果实中提取所得，其总甙含量＞83%。研究表明，栀子西红花总甙具有降低心肌收缩力、促进牛主动脉内皮细胞增生和防治动脉粥样硬化等功效［2］。

　　本文观察了栀子西红花甙对非啮齿类动物Beagle犬静脉注射给药13周后由于积蓄而对机体产生的毒性反应及严重程度，提供毒性反应的靶器

　　官及其损害的可逆性，确定无毒反应的剂量，以评估栀子西红花甙长期用药的安全性，为拟定人用剂量提供参考。

　　1　材　料

　　1.1　受试药物

　　栀子西红花总甙（Crocins）为深红色结晶粉末，其总甙含量＞83%，由南京泽辰科技有限公司提供，批号：991228。加5%葡萄糖输液溶解配成浓度为50 mg/ml母液备用，并等比稀释，配成相应浓度的溶液供试验用。每周配一次，4℃冰箱保存。

　　1.2　动物

　　Beagle犬，由上海市新冈实验动物场提供，动物合格证号：沪动合格证字119号。动物初始月龄为6～7月龄，初始体重6.0～8.1 kg，高、中、低剂量组和对照组每组4只，雌雄各半，雌性犬均无孕。单笼饲养，定量喂食，每只400 g/d，自由饮水。实验室温度18℃～20℃，相对湿度60%～85%。

　　2　方　法

　　犬购入后适应2周并观察一般行为表现。试验前称体重、量体温，观察进食情况，同时检测两次血常规、血液生化、尿常规、粪常规、心电图等指标。试验前1周用肠虫清驱虫及接种犬7联苗。

　　2.1　剂量设置及分组［3］

　　预试验中当剂量为250 mg/(kg*d)时（最大溶解度，最大给药容积），2条犬iv后，迅速出现用四肢挠痒、剧烈摩擦身体或甩头等皮肤搔痒症状，常伴有行为活动减少，神情呆滞等精神症状。故正式试验时，参照犬药效学有效剂量在12.5～25 mg/kg范围内，设长毒试验高剂量250 mg/(kg*d)，低剂量50 mg/(kg*d) ，中剂量为(高剂量×低剂量)开方而得112 mg/(kg*d)及5%葡萄糖输液对照组。

　　2.2　给药途径和方法

　　根据每犬体重及高、中、低剂量，栀子西红花甙以50 mg/ml为高剂量浓度等比稀释，匀速（5 ml /min）静脉推注，每天1次，每周给药6d，连续给药13周。对照组静脉注射等量5%葡萄糖输液。每周称体重一次，根据体重变化调整给药量。在最后一次给药后24 h，每组各处死动物2只（雌雄各1），观察并检测各项指标。余下动物停药后进行4周的恢复期观察。

　　2.3　检测项目及时间［4］

　　2.3.1　一般检查　每天观察外观体征和行为活动、进食情况、尿、粪、精神状态、恶心呕吐等症状。体温在给药前、给药后每月及恢复期结束各测定一次。

　　2.3.2　血液学检查　给药前及给药后第4、8、13周及停药恢复期末（第17周）各测1次，检测下列指标：红细胞计数（RBC）、血红蛋白（HGB）、红细胞压积（HCT）、白细胞计数（WBC）、淋巴细胞相对计数（LY%）、淋巴细胞绝对计数（LY#）、血小板计数（PLT）及凝血时间（CT）。

　　2.3.3　血液生化指标检查　检测时间及次数同2.3.2项，检测下列指标：门冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、总胆红素（TBIL）、血糖（GLU）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、总胆固醇（TC）。

　　2.3.4　心电图检查　ECG Ⅱ导联检测时间及次数，同2.3.2项。

　　2.3.5　尿液、粪便常规检查　检测时间及次数同2.3.2项。取尿行常规镜检并用尿液分析仪检测尿液，检测下列指标：葡萄糖（GLU）、尿胆红素（BIL）、酮体（KET）、pH值、蛋白质、尿胆原（URO）、亚硝酸盐（NIT）、隐血（BLO）及白细胞。粪便做常规镜检。

　　2.3.6　系统尸检和病理组织学检查　对全身各脏器进行肉眼检查，将心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肾上腺、胸腺、甲状腺、脑、子宫、卵巢、睾丸、前列腺等器官取出称重，计算其脏器系数（脏器重量/体重）。

　　对上述脏器及胰腺、脊髓、脑垂体、视神经、淋巴结、膀胱、骨髓（胸骨）、胃、十二指肠、回肠和结肠等用光镜作组织学检查。

　　2.3 统计方法

　　计量数据以给药前、后的差值在给药组与对照组间进行Student-t检验，等级资料以Wilcoxon法检验。

　　3　结　果

　　3.1　一般情况观察

　　栀子西红花甙高剂量组（250 mg/kg）给药后，迅速出现用四肢挠痒、剧烈摩擦身体或甩头等症状，一般在0.5 h内消失。皮肤上可见较大量的成片状分布的红色斑点，在给药后的1～2 h内逐渐消退，11周起该症状不明显。在给药期内皮肤、粘膜、巩膜等部位呈较深的黄色，给药后排出的尿液显红色，接近药液颜色，粪便呈棕褐色。给药后期，动物的毛色变得无光泽，皮肤油性分泌物增加，常伴有行为活动减少，神情呆滞等精神症状。4周恢复期时上述在给药后重复出现的症状不再出现，长期症状则减轻、消退。

　　栀子西红花甙中剂量组（112 mg/kg）动物在给药后上述症状较轻。

　　栀子西红花甙低剂量组（50 mg/kg）仅观察到给药后尿液轻度变黄，未见其它异常情况。各组动物的体重进食量及体温与对照组比较均无显著差异，粪便常规检查正常。

　　3.2　栀子西红花甙对犬血液学指标的影响

　　结果见表1。高剂量组给药后1月，PLT显著降低（降低47.5%，P＜0.01）；而2月时，WBC和LY#显著升高（分别为85.5%，P＜0.01；89.7%，P＜0.01）；3月时，WBC和LY#呈剂量依赖性升高，且高、中剂量组与对照组相比有显著差异。RBC、HGB、HCT及PLT呈剂量依赖性降低，且高、中剂量组与对照组相比有显著差异。其它各项指标，与对照组相比均未见明显差异（P＞0.05）。

　　3.3　栀子西红花甙对犬血液生化指标的影响

　　结果见表2。高剂量组1月时TBIL显著升高（升高203.8%，P＜0.05）；2月及3月时，TBIL呈剂量依赖性升高，且高、中剂量组与对照组相比有显著差异；高剂量组Cr显著降低，其余各点的指标变化都在正常范围内，且属散在个别的变化，无剂量相关性，故无临床意义。其它各项血生化指标与对照组比较均无显著差异（P＞0.05）。

　　3.4　栀子西红花甙对犬心电图的影响

　　各组给药1、2、3月及恢复期，心电图各项参数及心率与对照组相比均无显著差异（P＞0.05）。

　　3.5　栀子西红花甙对尿液、粪便常规的影响

　　各组动物给药前后尿液、粪便常规检查与对照组相比无显著差异。

　　3.6　系统尸检和病理组织学检查

　　尸体剖检大体外观检查仅高剂量组动物的皮肤、肌肉、粘膜、内脏表面等呈黄色，但脑、骨骼等颜色无明显异常。其余各组均无肉眼可见的病理改变。各组间所有脏器重量及脏器系数均没有明显的差异。

　　组织学检查表明，所有受检脏器与对照组相比均未见明显的病理改变。恢复期未见任何脏器有明显的异常改变。

表1　栀子西红花甙静脉注射给药3个月及4周恢复期对Beagle犬血液细胞学指标的影响(x-±s)

组别	时间 　　(月)	WBC 　　(109/L)	RBC 　　(1012/L)	HGB(g/L)	HCT 　　(%)	PLT 　　(109/L)	LY% 　　(%)	LY# 　　(109/L)	CT 　　(min)
高剂量组		12.08±2.47	4.89±0.53	117.0±14.4	31.85±3.68	330.2±174.6	58.8±6.6	7.00±0.74	0.44±0.13
中剂量组	0	12.00±1.92	5.06±0.21	119.2±1.5	31.70±0.81	401.2±141.6	65.2±3.9	7.88±1.69	0.38±0.07
低剂量组		9.10±1.31	5.02±0.38	118.5±7.9	32.20±1.94	308.2±53.5	62.8±6.7	5.60±1.36	0.32±0.02
对照组		9.05±1.39	5.11±0.15	121.5±6.8	33.42±1.78	322.2±68.8	62.2±6.9	5.58±0.69	0.31±0.05
高剂量组		17.60±5.18	5.40±0.58	126.0±16.6	36.02±4.46	161.0±22.31	51.5±7.6	9.18±3.54	0.34±0.09
中剂量组	1	18.70±8.83	5.71±0.32	130.8±9.5	37.00±2.75	221.2±91.4	48.0±11.2	9.65±6.84	0.31±5.34
低剂量组		12.68±2.13	5.81±0.59	135.0±16.2	38.18±3.64	207.8±89.6	57.8±7.1	7.32±1.42	0.41±0.18
对照组		11.25±1.72	6.00±0.54	141.5±12.4	39.70±3.17	306.5±15.7	49.8±5.9	5.60±1.19	0.34±0.11
高剂量组		21.82±2.501	4.94±0.19	112.8±5.7	33.25±1.45	122.8±39.5	51.5±9.5	11.38±3.072	0.59±0.24
中剂量组	2	12.85±2.19	5.01±0.24	114.2±7.1	32.78±2.42	151.8±27.2	48.8±4.0	6.28±1.07	0.60±0.30
低剂量组		12.28±4.57	4.53±1.31	104.5±31.1	29.92±8.72	162.5±75.9	60.5±10.6	6.10±1.56	0.48±0.21
对照组		11.70±4.09	5.24±0.32	120.5±2.5	34.62±1.11	169.5±35.4	52.0±5.7	6.00±1.88	0.64±0.30
高剂量组		47.32±18.402	4.12±0.441	91.2±12.0	27.58±3.321	126.0±37.01	43.5±5.7	20.55±7.762	0.66±0.33
中剂量组	3	29.40±5.901	4.92±0.182	110.2±4.62	32.72±1.462	123.5±37.51	49.8±8.5	14.75±4.742	0.35±0.19
低剂量组		17.42±2.48	5.16±0.27	116.5±7.5	34.35±1.74	124.0±24.81	48.8±2.2	8.52±1.56	0.42±0.19
对照组		13.50±5.08	5.53±0.45	127.5±11.0	36.98±2.81	217.5±242	51.2±5.6	6.75±1.96	0.77±0.33
高剂量组		12.50±4.10	6.16±0.36	141.0±5.6	40.15±1.48	192.0±56.6	51.5±3.5	6.50±2.54	0.65±0.26
中剂量组	恢复期	13.50±6.79	5.78±0.30	131.0±8.5	37.90±2.40	236.5±95.4	72.5±2.1	9.70±4.67	0.61±0.22
低剂量组		11.10±0.42	6.06±1.08	136.0±26.9	38.65±6.72	187.0±21.2	61.5±7.8	6.85±1.06	0.32±0.04
对照组		15.85±6.15	6.46±0.79	153.5±13.4	43.15±2.90	253.0±53.7	54.5±13.4	8.25±1.20	0.42±0.20

　　与对照组比较：1 P＜0.01，2 P＜0.05

　　表2　栀子西红花甙静脉注射给药3个月及4周恢复期对Beagle犬血生化指标的影响(x-±s)

组别

时间 　　(月)

ALT 　　(U/L)

AST 　　(U/L)

ALP 　　(U/L)

TBIL 　　(μmol/L)

TP 　　(g/L)

ALB 　　(g/L)

TC 　　(mmol/L)

BUN 　　(mmol/L)

Cr 　　(μmol/L)

GLU 　　(mmol/L)

高剂量组

40.88±9.420

33.12±6.03

183.2±20.6

2.68±1.11

59.70±3.40

30.40±1.19

2.93±0.45

2.22±0.53

60.2±2.8

4.18±0.29

中剂量组

0

43.22±18.29

33.72±2.78

182.2±25.8

1.60±1.47

60.00±3.37

29.85±2.20

2.79±0.52

2.72±1.00

65.0±5.5

4.22±0.70

低剂量组

35.35±4.60

32.78±8.47

165.2±35.3

1.48±1.14

57.48±3.48

28.80±0.57

2.65±0.40

3.08±1.04

63.0±4.7

4.40±0.14

对照组

36.32±8.47

31.95±8.38

185.0±24.5

2.52±1.98

58.00±1.51

30.18±1.61

3.12±0.36

2.58±0.57

62.0±1.6

4.72±0.36

高剂量组

104.40±62.10

51.60±24.77

218.2±35.2

16.65±5.741

63.32±1.80

31.2±1.31

3.01±0.77

3.88±0.81

47.8±2.6

1.48±0.94

中剂量组

1

95.30±42.83

38.05±14.86

204.5±33.1

3.82±1.88

60.35±3.82

29.4±2.82

2.56±0.26

4.08±0.42

50.0±11.5

2.39±1.34

低剂量组

54.32±19.47

31.62±17.62

189.0±46.2

2.88±3.35

65.52±7.98

32.3±3.67

2.63±0.28

4.00±0.35

67.5±46.8

2.21±0.89

对照组

52.32±20.35

29.78±22.74

237.0±30.3

5.48±6.54

61.95±4.81

32.2±1.85

2.99±0.45

4.08±0.66

51.2±16.7

2.58±1.08

高剂量组

65.10±23.92

32.70±21.44

105.0±34.3

18.98±33.45

52.48±34.73

25.82±12.81

1.82±1.22

3.45±1.67

33.2±21.71

2.58±1.211

中剂量组

2

78.25±29.91

37.55±8.53

140.0±37.4

13.98±6.002

65.88±3.91

31.95±1.12

2.55±0.36

5.22±2.26

60.2±7.5

4.29±0.20

低剂量组

129.45±76.82

35.95±5.58

134.8±17.3

6.98±7.44

52.72±24.4

31.58±1.84

2.43±0.43

5.38±1.78

59.0±13.5

4.10±0.56

对照组

47.95±11.18

36.08±6.81

151.0±48.8

2.28±1.04

63.98±5.95

32.38±2.78

3.12±0.75

4.55±1.29

64.5±3.11

4.44±0.73

高剂量组

26.25±14.94

27.88±1.16

161.0±35.7

126.9±10.22

64.68±2.38

31.92±1.62

3.22±0.26

3.88±0.87

22.0±2.42

3.56±0.71

中剂量组

3

25.72±3.54

29.02±2.69

158.5±21.7

11.2±1.52

61.92±3.311

28.78±1.052

3.08±0.38

4.82±0.44

56.0±4.7

3.56±0.201

低剂量组

69.20±27.251

32.40±5.88

159.0±20.1

1.4±0.8

61.65±1.642

29.48±2.17

2.97±0.64

5.48±1.31

61.0±3.37

3.68±0.31

对照组

32.45±8.53

37.32±11.38

158.0±56.4

0.2±0.2

67.72±2.55

34.92±2.19

3.28±0.74

4.15±0.78

57.0±2.83

4.48±0.63

高剂量组

34.45±2.90

43.45±0.35

78.5±34.6

1.20±0.42

65.25±1.77

32.55±2.19

3.32±0.33

4.45±1.06

59.5±7.8

5.49±0.42

中剂量组

恢复期

28.25±5.44

43.95±2.33

77.0±7.1

1.85±0.07

64.15±0.07

32.50±3.82

3.14±0.22

5.45±0.78

63.0±4.2

6.25±0.24

低剂量组

24.72±5.82

52.45±19.16

61.5±7.8

1.10±0.28

58.25±1.48

30.50±0.56

3.11±0.03

5.00±0.85

61.0±0.0

5.46±0.13

对照组

38.15±3.18

70.45±30.19

77.0±24.0

1.85±0.35

66.40±6.93

32.50±2.69

3.11±0.08

5.05±1.48

59.0±1.4

5.76±1.41

　　与对照组比较：1 P＜0.05，2 P＜0.01

　　4　讨　论

　　Beagle犬连续静脉注射给予栀子西红花甙13周后，高剂量组动物的毒性表现主要为皮肤搔痒并出现红色斑点等副反应，这是否为过敏反应有待于进一步证实。皮肤、粘膜、巩膜等染成黄色，尿液、粪便颜色加深，且生化指标TBIL显著升高，可能与栀子西红花甙的自身色素有关。同时，对犬的神经精神系统有一定的抑制作用，并可显著升高WBC，这与栀子提取物具有镇静、镇痛和抗炎的药理学作用有关［2］。RBC、HGB、HCT明显降低的作用是否与民间用于治疗由于高原反应所致的红细胞增多症有关，还有待于临床验证。

　　在本试验条件下，栀子西红花甙连续静脉注射给药13周对Beagle犬的无毒剂量为50 mg/kg。

参考文献

　　1，杨春澍. 药用植物学. 上海∶上海科学技术出版社, 1997∶289

　　2，郑虎占, 董泽宏, 余靖主编. 中药现代研究与应用(第四卷). 北京∶学苑出版社, 1988∶3166～3187

　　3，袁伯俊，顾长虹. 新药长期毒性实验的剂量设计. 国外医学——药学分册，1997，24(2)∶ 97～101

　　4，袁伯俊，王治乔主编. 新药临床前安全性评价与实践. 北京∶军事医学科学出版社，1997∶11