雅致枝霉TE7-15发酵生产γ-亚麻酸的实验研究

　　 摘　要　目的：开发生产γ-亚麻酸(GLA)新的微生物资源。方法：研究温度、时间、碳源和氮源对雅致枝霉(Thamnidium elegans)诱变株TE7-15的菌体生长、油脂积累及GLA合成的影响。结果：确定了TE7-15菌株适宜的摇瓶发酵培养条件，其菌体生物量达到19.04 g/L，GLA产量达到1 079.95 mg/L。结论：该菌株可以满足工业化生产的要求。

　　中图分类号　Q93-33

Study on the Production of γ-Linolenic Acid by the Fermentation of Thamndium Elegans TE7-15

Zhang Ling　Li Zhifeng　Lai Bingsen　Shen Xiaojing　Tan Yafang　Sun Shuqin

　　（Beijing Military Medical College (Beijing 100071）

　　Abstract　Purpose:The aim is to exploit a new microoganism resource for γ-linolenic acid(GLA) production.Methods: The effects on fermentation conditions,such as temperature,fermentation time,carbon source and nitrogen source on cell growth and lipid formation of Thamnidium elegans TE7-15 strain were studied.Results:The optimum culture medium and culture conditions were established,and the dry cell weight and γ-linolenic acid yield were 19.04 g/L and 1 079.95 mg/L under the conditionrespectively.Conclusion:The strain may be used for the industrial production of GLA.

　　Key words　Thamnidium elegans, Fermentation, γ-linolenic acid

　　γ-亚麻酸(γ-Linolenic acid,GLA)属于多不饱和脂肪酸，对治疗糖尿病、皮肤老化症、心血管疾病等均有一定疗效，故常作保健食品的功能因子或药品。

　　GLA过去多从月见草籽中提取，这易受种植等因素的限制。微生物发酵生产GLA具有生长速度快、培养简单且原料不受限制等特点，所以越来越受到人们的重视［1］。目前国内多采用被孢霉(Mortierella)发酵生产GLA［2，3］，我们以雅致枝霉为出发菌株，对其进行了诱变育种，获得高产GLA的诱变株TE7-15。本文对其发酵条件进行了研究，旨在开发生产GLA的新的微生物资源。

　　1　材料和方法

　　1.1　菌株和培养基

　　雅致枝霉(Thamnidium elegans)AS 3.345 6，中国科学院微生物研究所国家菌种保藏中心；雅致枝霉TE7-15突变株是AS 3.3456菌株经5-氟尿嘧啶、紫外线和氯化锂复合诱变选育而得。

　　斜面培养基：霉菌培养基，北京市海淀区微生物培养基制品厂；种子培养基(g/L)：葡萄糖30，酵母粉1.0，蛋白胨1.0，麦芽汁1.0，KH2PO4 2.0，柠檬酸钠0.5，CuSO4 0.5×10-3，ZnSO4 7.5×10-3，MnSO4 2.0×10-3， pH 6.0；基础发酵培养基(g/L)：葡萄糖50，酵母粉1.0，蛋白胨5.0，KH2PO4 2.0，CaCO3 0.3，MgSO4 0.3，CuSO4 0.5×10-3，ZnSO4 7.5×10-3，MnSO4 2.0×10-3，柠檬酸钠2.0，pH 6.0。

　　1.2　菌株的培养与处理

　　菌种在斜面培养基上于15℃培养5 d，活化。将活化后的菌种接种于种子培养基，以100 ml的三角瓶装液10 ml，在15℃下，120 r/min培养24 h。

　　在装有培养基100 ml的500 ml三角瓶接入种子液，接种量10%，15℃，140 r/min培养5 d。发酵液经的确良布过滤，蒸馏水洗涤后，称湿重，取部分湿菌体，100℃烘干至恒重，冷却后称干重，以确定菌体得率［4］。

　　1.3　分析方法

　　1.3.1　菌体油脂的提取　湿菌体按每克菌加4 mol/L HCl 6 ml混匀，室温放置1 h，于沸水浴煮沸3 min，置于冰室速冷，然后加入氯仿及甲醇(1∶1)，混匀后离心，挥发除去氯仿即得油脂［5］。

　　1.3.2　油脂中脂肪酸的气相色谱分析

　　1.3.2.1　油脂的甲酯化处理　油脂加入皂化液(0.5 mol/L KOH-甲醇)2 ml，混匀，于60℃水浴皂化至油珠消失，冷却后加入甲酯化液(14%三氟化硼-甲醇)2 ml，于60℃水浴甲酯化30 min，冷却后加入正己烷1 ml，饱和氯化钠1 ml，离心后取上清液，即可用于气相色谱分析。

　　1.3.2.2　标准品　以高纯度的GLA甲酯(Sigma产品，纯度99%)作为标准品。

　　1.3.2.3　仪器和工作条件　用PE-XL气相色谱仪分析油脂组成；FAMEWAX石英毛细管色谱柱，柱长30 m，内径0.32 mm，液膜厚0.35 μm。检测器为氢火焰离子化检测器(FID)。程序升温条件为：柱温190℃时，以0.3℃/min升至191℃，再以4℃/min升至225℃，维持15 min。

　　2　结　果

　　2.1　不同碳源对菌体生长及GLA产量的影响

　　在培养基中加入不同碳源进行对比实验(表1)，结果表明，可溶性淀粉和蔗糖均不利于菌体生长及油脂积累；蔗糖有利于GLA的合成，但GLA是胞内脂肪酸，我们不能以GLA含量作为唯一指标，必须同时考察菌体干重及油脂产率，因此只有葡萄糖对各项指标可以兼顾。

表1　两种碳源浓度对菌体生长及GLA产量的影响

碳源	DC 　　(g/L)	TL 　　(g/L)	TL/DC 　　(%)	GLA 　　［mg/L(%)］
葡萄糖	19.52	3.01	15.43	817.52	(27.16)
可溶性淀粉	5.86	0.47	8.02	25.10	(　5.34)
蔗　糖	9.09	0.55	6.54	167.14	(30.39)

　　DC为菌体干重；TL为油脂含量；GLA(%)为油脂中GLA的百分率，即GLA/TL

　　2.2　不同氮源对菌体生长及GLA产量的影响

　　本实验以葡萄糖为碳源，采用不同氮源进行比较实验，结果(表2)表明，利用尿素作氮源虽然有利于菌体生长，但不利于油脂的积累；(NH4)2SO4有利于促进GLA的合成，但不利于菌体生长；而KNO3、蛋白胨对菌体生长及GLA产量的影响相近，对各项指标均可兼顾，但蛋白胨成本较高，所以我们选择KNO3作为氮源。

表2　不同氮源对菌体生长及GLA产量的影响

氮源	DC 　　(g/L)	TL 　　(g/L)	TL/DC 　　(%)	GLA 　　［mg/L(%)］
KNO3	17.94	3.06	17.03	858.51	(28.10)
尿素	19.47	1.07	5.51	282.69	(26.42)
(NH4)2SO4	9.39	1.54	16.36	468.31	(30.41)
蛋白胨	18.65	3.11	16.69	847.58	(27.23)

　　2.3　不同温度对菌体生长及GLA产量的影响

　　我们采用不同温度进行培养，结果(表3)表明，该菌株要求适当的低温环境，12℃既有利于菌体生长，也有利于积累油脂并合成GLA。

表3　不同温度对菌体生长及GLA产量的影响

温度 　　(℃)	DC 　　(g/L)	TL 　　(g/L)	TL/DC 　　(%)	GLA 　　［mg/L(%)］
8	12.34	1.16	9.43	213.18	(18.32)
12	17.81	3.09	17.36	856.12	(27.69)
15	18.91	2.71	14.35	818.68	(30.21)
25	10.42	0.61	5.89	156.11	(25.59)

　　2.4　不同培养时间对菌体生长及GLA产量的影响

　　由表4可以看出，随培养时间的延长，菌体生长、油脂积累都逐渐增多，超过184 h油脂积累虽然仍在增多，但菌体生长逐渐减慢，且GLA合成比例逐渐下降即GLA合成的增加量与培养时间不成正比，继续延长时间则油脂积累也减少，所以综合评价后，我们选择培养时间为10 d。

表4　不同培养时间对菌体生长及GLA产量的影响

培养时间 　　(h)	DC 　　(g/L)	TL 　　(g/L)	TL/DC 　　(%)	GLA 　　［mg/L(%)］
136	17.29	2.60	15.01	628.30	(24.21)
184	19.52	3.00	15.39	784.38	(26.11)
240	18.32	3.05	16.65	881.45	(28.90)
284	18.83	3.10	16.46	830.18	(26.78)

　　2.5　优化培养条件的确立

　　在上述实验基础上，我们又进行了葡萄糖浓度的选择、碳/氮比值的选择，最终确立的培养基组分为(g/L)：葡萄糖100，酵母粉1.0，蛋白胨1.0，KNO3 5.0，KH2PO4 2.0，CaCO3 0.3，MgSO4 0.3，CuSO4 0.5×10-3，ZnSO4 7.5×10-3，MnSO4 2.0×10-3，柠檬酸钠2.0，pH 6.0。培养温度为12℃，培养时间为10 d。以此条件进行摇瓶发酵实验，结果见表5。

表5　发酵验证实验

培养基	DC 　　(g/L)	TL 　　(g/L)	TL/DC 　　(%)	GLA 　　［mg/L(%)］
基础配方	17.65	3.25	18.43	903.65(27.78)
优化配方	19.04	3.94	20.67	1 079.75(27.41)

　　3　讨　论

　　本研究对雅致枝霉诱变株TE7-15进行了优化培养，调整了碳源、氮源等指标，初步确立了发酵培养条件。发酵实验结果表明：每升培养物菌体干重为19.04 g，油脂含量为2.25 g，GLA含量占总脂的27.41%，即每升发酵液产GLA 1.08 g，已达到工业化生产的指标，为GLA的发酵生产提供了新的菌株。

　　目前国内利用微生物发酵生产GLA的研究多采用被孢霉，如深黄被孢霉［2］、高山被孢霉［6］等，其菌体生物量及产脂率均较高，但GLA在总脂中比例为8%～15%，而TE7-15诱变株产生的GLA在总脂中比例较高，经多次实验测定均在25%以上，这一特点为GLA的提取、纯化提供了便利条件。

参考文献

　　1，关洁雯，林炜铁，姚汝华.被孢霉产γ-亚麻酸的补料工艺研究.食品与发酵工业，1998，24(5)∶18～20

　　2，张峻，邢来君，王红梅.γ-亚麻酸高产菌株的选育及发酵产物的分离提取.微生物学通报，1993，20(3)∶140～143

　　3，赵人俊，严虹，郑幼霞.影响被孢霉产生含γ-亚麻酸的油脂的几种因素.生物工程学报，1995，11(4)∶361～365

　　4，吴水清，姚汝华.真菌产生多不饱和脂肪酸的研究.中国生化药物杂志，1997，18(3)∶127～129

　　5，张玲，李植峰，谭亚芳，等.一种简便、快速的真菌油脂提取方法.生物技术，1999，9(6)∶43～44

　　6，张道海，王未名，陆文华.被孢霉MA90发酵生产γ-亚麻酸的研究.生物技术，1995，5(1)∶27～29