人内皮抑素基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

　　摘要　目的：克隆人内皮抑素(hES)全长cDNA，并进行其在大肠杆菌表达的研究。方法：用RT-PCR从胎肝RNA中扩增hES cDNA片段，构建重组其克隆和融合蛋白表达载体，并进行克隆基因的DNA序列分析。结果：克隆了hES cDNA，其序列和国外报道一致；构建了重组hES融合蛋白表达菌株，表达目的蛋白达菌体总蛋白的50%以上。结论：通过hES基因克隆和表达的研究，获得了hES的基因克隆和高效表达菌株。

　　中图分类号　Q503

Cloning and Expression of Human Endostatin Gene in E.coli

Zhao Yueran, You Li, Zhang Jian, Gao Chunyi, Tian Zhigang

　　(Shandong Cancer Biotherapy Center,Institute of Basic Medical Sciences,

　　Shandong Academy of Medical Sciences (Jinan 250062)

　　Abstract　Purpose:The aim is to clone and express recombinant human endostatin(hES)in E.coli.Methods:The hES gene was cloned with RT-PCR from human fetal liver total RNA,and sequenced using ABI DNA sequencer.Expression recombinant was constructed,and the hES fusion protein was purified and cleaved with factor Xa.RhES was separated with amylose resin affinity chromatography.Results:The DNA sequence of cloned hES gene was similar to that reported previously,and fusion protein of recombinant hES expressed was above 50% of total bacterial proteins.Conclusion:The hES gene and its recombinant with high level expression were obtained.

　　Key words　Endostatin, Expression, Fusion protein

　　内皮抑素(endostatin,ES)为新近发现的血管内皮细胞生长抑制因子，分子量为20 kD［1］。研究证明，ES是胶原XVⅢ的酶解产物，而胶原XVⅢ本身并不具备抑制血管内皮的活性，ES是其非胶原结构区的C末端片段(806-989aa)［2］。由于ES通过抑制肿瘤新生血管形成而对原发和转移瘤均表现极强的抑瘤活性，有可能成为新型肿瘤治疗制剂，因此引起了人们极大的关注［1，3，4］。为了进一步探讨ES用于肿瘤生物治疗的可行性，我们进行了人ES(hES)的基因克隆和表达研究，结果报道如下。

　　1　材料和方法

　　1.1　材料

　　pUC18,Promega公司；pMAL-p2、DH5 α，英国Paterson肿瘤研究所Mackett博士惠赠；逆转录酶M-MLV RTase、EcoR Ⅰ、Sa1 Ⅰ、BamH Ⅰ、Xmn Ⅰ和T4DNA连接酶，美国Gibco公司；pfu DNA聚合酶、随机六聚体引物和dNTP，上海生工生物公司；Amylose resin和Factor Xa,New England Biolabs；其它为分析纯试剂。

　　胎肝取自水囊引产的正常胎儿。

　　1.2　方法

　　1.2.1　引物的设计与合成　根据文献报道序列设计，由上海生工生物工程公司合成。上游引物P1：5′-TAGAATTCATGCACAGCCGCGACTTCCAG-3′；上游引物P2：5′-CACAGCCACCGCGACTTCC-3′；下游引物P3：5′-ATGGATCCTTACTTGGAGGCAGTCATGAAG-3′。

　　1.2.2　胎肝总RNA的提取　按本室建立的RNA快速提取法［5］进行。

　　1.2.3　RT-PCR　胎肝总RNA 5 μg，加入随机六聚体引物2 μg，M-MLV转录酶，RNasin和dNTP,37℃反应1 h，合成cDNA。取逆转录反应物5 μl，加入上、下游引物，dNTP,pfu DNA聚合酶，进行PCR。反应条件为94℃ 1 min、65℃ 1 min、72℃1.5 min，进行30个循环。

　　1.2.4　重组克隆的构建及酶切鉴定　重组血管抑素基因克隆、表达体的构建及筛选均按文献［6］方法进行。

　　1.2.5　DNA序列分析　用ABI DNA序列分析仪进行。

　　1.2.6　蛋白质表达的诱导　重组血管抑素表达菌株在含氨苄青霉素(100 μg/ml)的LB培养基中37℃振荡培养，OD600至0.5～1.0时，加入IPTG终浓度为0.3 mmol/L，继续培养4 h。

　　1.2.7　蛋白纯化　IPTG诱导重组菌株，4℃离心4 000×g，20 min，悬浮于裂解液(Tris-HCl pH 7.4 10 mmol/L，NaCl 200 mmol/L,EDTA 1 mmol/L,二巯基苏糖醇 1 mmol/L)中，5 g湿菌/L，-20℃过夜，冰浴中超声破碎，于4℃ 9 000×g离心30 min，上清用裂解液稀释，使蛋白浓度为2.5 mg/ml左右。上Amylose亲和层析柱，流速为1 ml/min，8倍柱体积的裂解液洗柱。然后用洗脱液(含10 mmol/L麦芽糖的裂解液)洗脱重组蛋白。

　　洗脱的融合蛋白加入蛋白酶Factor Xa，二者相对量为200/l(w/w)，室温反应8 h，将hES从融合蛋白上切下。切割反应物，于洗脱液中进行透析，每3 h换液一次，透析过夜。透析的切割反应液上Amylose亲和层析柱，流速为0.3 ml/min，合并收集流出液。

　　1.2.8　SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)　IPTG诱导的重组菌株及分离纯化的蛋白按常规方法进行14%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分析。

　　2　结　果

　　2.1　hES的PCR扩增

　　胎肝组织总RNA以随机六聚体为引物，经M-MLV逆转录酶反转录，然后用hES特异性上、下游引物P1和P3进行PCR扩增。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，扩增产物为500 bp左右的DNA带(图1)。

　　2.2　hES cDNA的克隆

　　PCR产物经EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ消化，插入相应酶切的克隆载体pUC18构建重组质粒。用酶谱分析和DNA测序鉴定重组质粒，结果显示获得的内皮抑素基因和文献报道一致，获得ES重组质粒pUC18-ES(图2、图3)。

　　2.3　表达载体的构建及鉴定

　　以pUC18-ES为模板，P2和P3作为上、下游引物进行PCR扩增ES基因。用PCR产物经BamH Ⅰ酶切，其下游为粘末端，上游为平端，插入Xmn Ⅰ和BamH Ⅰ消化的表达载体pMAL-p2。菌落PCR筛选重组表达菌株，DNA序列分析显示ES正向插入pMAL-p2蛋白酶Factor Xa识别序列的下游，获得重组表达载体pMAL-p2-ES(图2)。

　　2.4　表达产物的鉴定

　　诱导重组菌株进行SDS-PAGE分析，在约60 kD处见一极为明显的蛋白带。融合蛋白前体麦芽糖结合蛋白(Maltose binding protein,MBP)的分子量为40 kD，hES的分子量为20 kD，60 kD处的表达带和融合蛋白预期的分子量一致(图4)。融合蛋白主要存在于细菌破碎物的上清中，说明融合蛋白在菌体中并非以包涵体的形式存在。SDS-PAGE扫描表明，融合蛋白占菌体总蛋白的50%以上，提示获得高水平的表达菌株。

　　2.5　蛋白质的纯化和切割

　　细菌破碎液上清经Amylose树脂亲和层析纯化，获得融合蛋白，分子量为60 kD。用蛋白酶Factor Xa消化融合蛋白，分离融合蛋白前体MBP和重组hES(rhES)。切割反应物经亲和层析，获得纯化的rhES(图5)。

　　3　讨　论

　　和正常组织一样，肿瘤的生长也依赖于充足的血液供应。肿瘤组织新生血管的生成对肿瘤的生长、浸润和转移具有重要的意义［7］，因而抗血管生成治疗成为当今肿瘤治疗研究的热点之一［8］。ES作为迄今为止发现的最强的肿瘤血管生成抑制剂，明显抑制实验性肿瘤的生长和转移，在肿瘤治疗方面具有极大的潜在应用价值。为此我们开展了ES基因克隆和表达的研究。

　　在进行ES基因克隆时，用pfu DNA聚合酶取代了传统的Taq酶。因为pfu具有3′→5′外切酶活性，在PCR扩增时，具有校阅功能，其PCR产物的保真性远远高于传统的Taq DNA聚合酶。用其进行hES基因的扩增，减少了PCR扩增中的碱基的错配，保证了扩增的hES基因的真实性。序列分析证实克隆的hES基因未产生突变。

　　为了增加重组蛋白的稳定性和便于重组蛋白的纯化，采用MBP融合蛋白表达载体进行rhES表达研究。将ES编码序列正向插入MBP的蛋白酶切割位点的下游，使内皮抑素的N端第一个氨基酸恰位于蛋白酶Factor Xa识别切割序列(Ile-Glu-Gly-Arg)的下游。据核苷酸序列分析推测融合蛋白切下的rhES氨基酸序列和天然的ES一致，但ES的氨基酸序列将通过N端序列测定确证。SDS-PAGE凝胶扫描结果表明，获得了高效重组蛋白表达菌株，融合蛋白占菌体总蛋白的50%，推测ES的表达量达菌体总蛋白的15%以上。

　　ES通过抑制毛细血管内皮细胞生长而阻断肿瘤组织新生血管的形成，但ES抑制内皮细胞的机制尚不清楚。hES基因的克隆和rhES的获得，不但对探讨ES与内皮细胞相互作用的分子机制具有重要意义，而且也为开展抗血管生成的基因治疗奠定了基础。

参考文献

　　1，O'Reilly MS,Boehm T,Shing Y,et al.Endostation:An endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth.Cell,1997,88∶277～285

　　2，Oh SP,Warman ML,Seldin MF,et al. Cloning of cDNA and genomic DNA encoding human type XVⅢ collagen and localization of the α 1(XVⅢ) gene to mouse chromosome 10 and human chromosome 21.Genomics,1994,19∶494～499

　　3，Bergs G,Javaherian K,Lo KM,et al.Effects of angiogenesis inhibitors on multistage cacinogenesis in mice.Science,1999,284∶808～812

　　4，Dhanabal M,Volk R,Ramchandran R,et al. Cloning,expression and in vitro activities of human endostatin.Biochem Biophys Res Commun,1999,258∶345～352

　　5，游力，赵跃然，张建，等.一种用矽石快速提取总RNA的方法.细胞生物学杂志，1999，21∶96～98

　　6，Sambrook J,Fritsch EF,Maniatis T.Molecular cloning∶a laboratory manual.2nd ed.New York∶CSLP,1989∶21～66

　　7，Szabo S, Sandor Z.The diagnostic and prognostic value of tumor angiogenesis.Eur J Surg,1998,582(Suppl)∶99～103

　　8，Hayes AJ,Li LY, Lippman ME.Science,medicine,and the future.Antivascular therapy:a new approach to cancer treatment.BMJ,1999,318∶853～856