人胃癌细胞中COX-2基因的表达及其生物学活性

www.cnkang.com 2007-3-20 16:13:00 中华康网

　　摘要：目的为研究环氧合酶2(cyclooxygenase2,COX-2)或通过前列腺素(prostaglandin,PG)引起的肿瘤免疫机制，我们检测了人胃癌细胞中COX-2mRNA及蛋白质水平的表达,PGE2的释放和COX-2酶活性的抑制剂消炎痛(indomethacin,Indo)对PGE2的释放和肿瘤细胞生长的影响。方法采用免疫细胞化学染色、RTPCR，ELISA，以及MTT比色试验方法研究人胃癌细胞COX-2基因与蛋白质的表达、PGE2释放以及消炎痛对PGE2释放和细胞活力的影响。结果所有检测的胃癌细胞均表达COX-2mRNA,胃癌细胞MKN45,SGC7901和AGS中有COX-2蛋白质的表达,MGC803则不表达。ELISA表明，所有胃癌细胞均有PGE2释放，给予COX-2表达的诱导剂PMA后，MGC803中PGE2的释放由57μg/L增加至63μg/L，小剂量COX-2酶活性的抑制剂—消炎痛(0.125μmol/L)则可使其水平降至47μg/L。MTT法进一步显示，消炎痛可使肿瘤细胞增殖与活力明显抑制，尤以小剂量为著。结论人胃癌细胞中存在COX-2基因的表达、PGE2的释放及肿瘤细胞增殖之间的相互关联。

　　中图号：R735.2　文献标识码：A　文章编号：1007－8738(2000)03－0255－05

Expression and biological activity of COX-2 gene in human

　　gastric cancer cell lines

LI Ling　WU Kai-chun　WU Han-ping　WANG Xin　NIE Yong-zhan　FAN Dai-ming

　　（Institute of Digestive Diseases, Xijing Hosiptal,Fourth Military Medical University,Xi'an 710033,Shaanxi Province,China）

　　Abstract: Aim To detect the expression of COX-2, the level of PGE2 in human gastric cancer cell lines and the inhibition of indomethacin on cell growth and PGE2 level, so to elucidate the role of cyclooxygenase 2 (COX-2) and prostaglandin (PG) in tumor immunity. Methods Immunohistochemistry, RT PCR, MTT assay and ELISA were used. Results COX-2 mRNA expression was observed in all gastric cancer cell lines (MKN45, SGC7901, AGS, MGC803);but COX-2 protein expression was only shown in MKN45, SGC7901 and AGS. ELISA exhibited that all gastric cancer cell lines produced PGE2, and PMA increased the level of PGE2 in MGC803 (from 57 μ g/L to 63 μ g/L), while 0.125 μ mol/L indomethacin decreased the level to 47 μ g/L. Indomethacin inhibited proliferation and activity of SGC7901 in MTT assay. Conclusion COX-2 gene expression exists in human gastric cancer cell lines, and there seems to be correlation between COX-2 expression, PGE2 production and cell proliferation.

　　Keywords: COX-2; expression; PGE2; tumor■

　　环氧合酶-2(cyclooxygenase2,COX-2)是前列腺素(prostaglandin,PG)生物合成过程中的一个重要限速酶，可将花生四烯酸代谢为各种PG产物，从而维持机体的病理生理过程。生理状态下PG由单核－巨噬细胞系统产生，以调节细胞因子的平衡。炎症时诱导IL-6产生的物质同时可诱导COX-2mRNA的产生，而且在炎症部位IL-6和COX-2mRNA表达同时上调，从而调动机体对炎症的免疫应答；而应用COX-2的选择性抑制剂(NS-398)则可使IL-6的产生受抑制〔1〕。已有大量研究报道，肿瘤组织(如头颈、胸、肺和结肠等)可产生较高水平的PG。吴开春等〔2〕曾报道，同正常组织相比较，胃癌组织产生PGE2的水平增高。PG在肿瘤发生中的作用表现为：影响有丝分裂，促进细胞粘附，抑制凋亡发生及减低免疫监视机能〔3〕。肿瘤组织PG产生的增加常伴有COX活性，尤其是COX-2活性的增加，同时可有COX-2表达增加。我们应用免疫组化染色显示，胃癌组织COX-2蛋白的表达(65.5％)显著高于浅表性胃炎(18.2％)。为进一步了解基因水平上COX-2的表达，探讨COX2,PG与肿瘤这三者之间的关系，我们采用免疫组化染色,RT-PCR,ELISA和MTT等方法，检测了COX2的表达和PGE2的释放，并分析了COX-2表达的诱导剂及酶活性的抑制剂对PGE2释放和细胞增殖的影响。

　　1　材料和方法

　　1.1材料人胃癌细胞MKN45，SGC7901，AGS和MGC803均为本所保存。RPMI1640，DMEM

　　培养基及DMEM/F12培养基购自Gibco公司。胎牛血清购自Hyclone公司。兔抗人COX1和COX2多克隆抗体购自Cayman公司。SABC免疫酶染色试剂盒及DAB显色试剂盒，购自武汉博士德公司。总RNA超绝UNIQ10抽提试剂盒及Taq酶，购自NSBCSangon公司。MMuLv购自MBI公司。100bpDNAladder购自华美生物工程公司。PGE2ELISA试剂盒购自Amersham公司。PMA及消炎痛为Sigma公司产品。

　　1.2方法

　　1.2.1RTPCR①细胞的收集：取对数生长期的细胞(有血清或无血清)，用血细胞计数器计数达2×107时，用2.5g/L胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，经500r/min离心10min，收集细胞沉淀，再以0.01mmol/LpH7.4PBS洗涤沉淀1次，于70℃保存。②细胞总RNA的提取：应用NSBC超绝UNIQ10柱总RNA抽提试剂盒，将抽提的RNA样品进行甲醛变性胶电泳了解其完整性，并用分光光度计测定A260nm及A280nm值分析其纯度,同时进行定量。③cDNA的合成：于冰上混合1μgRNA样品及1.2μL随机六聚体引物，于70℃退火5min后，立即置于冰浴中，加入4μL逆转录酶缓冲液,1μL20～40Mu/LRNasin及2μL10mmol/LdNTP，充分混合，25℃5min；最后加入2μLMMuLV逆转录酶，补加水至20μL，于25℃5min,37℃60min,70℃加热10min终止反应，4℃保存。④PCR：引物序列hCOX2为:

　　P1：5′TAGAACCCACTCCAAACACAG3′；

　　P2：5′TCATCAGGCACAGGAGGAAG3′.

　　PCR扩增片段长度为232bp；反应体系为：0.8μLcDNA，2μL10×Taq酶缓冲液，0.4μL10mmol/LdNTP，0.8μL25mmol/LMgCl2，上下游引物各0.4μL及0.5μLTaq酶，补加水至20μL。分别以去离子水代替模板作为阴性对照，以人结肠癌细胞Caco2之模板为阳性对照。PCR条件：95℃变性45s，54℃复性90s，72℃延伸90s，共30个循环。最后于54℃延伸2min，72℃延伸3min。反应完毕后，取10μL扩增产物，于17g/L的琼脂糖凝胶上进行电泳分析。为比较各细胞间表达水平的强弱,应用图象分析仪对扩增条带做了扫描半定量。

　　1.2.2免疫细胞化学染色①细胞的培养与固定：人胃腺癌细胞系(MKN45，SGC7901，AGS和MGC803)的培养液，为RPMI1640(含100mL/L热灭活胎牛血清)或为DMEM/F12无血清培养基，于37℃，50mL/LCO2孵箱中培养。待细胞生长至70％～80％时，用2.5g/L胰蛋白酶和0.2g/LEDTA消化，制备单细胞悬液，接种于载玻片上，置37℃培养8～10h。待细胞贴壁后，取出，用冷丙酮于室温固定10min，20℃保存。②SABC法染色：主要步骤为：3mL/LH2O2及甲醇室温30min，3g/LTritonX10037℃12min，30mL/L正常羊血清室温封闭2h。依次加1:125的兔抗人COX1和2多抗(置湿盒内4℃过夜)，1:100生物素化的羊抗兔IgG(37℃1h)及ABC复合物(37℃40min)，最后以DAB显色并封片、镜检。实验中以同等稀释度的兔血清及PBS代替一抗作为阴性对照，以人结肠癌细胞Caco2作为阳性标本对照。

　　1.2.3ELISA以SGC7901和MGS803为研究对象，分为a,b,c3个组，分别接种于9cm的培养皿。a组加同等稀释度的DMSO，b组加25μg/LPMA孵育3h，c组加0.125μmol/L消炎痛，孵育24h,至相应的时间段分别收集上清及细胞沉淀。取0.5mL培养上清，加入0.5mL800mL/L乙醇及10μL冰醋酸轻微混合，室温静置5min，以2500r/min离心2min,收集上清。取105细胞沉淀，用PBS洗涤两次，加入100μL细胞裂解液，置室温孵育10min，用加样器反复抽吸混匀。所制备的样品均须立即使用。将50μL标准品和等量样品分别加至相应孔中，再加入50μL稀释的PGE2抗血清和50μL稀释的PGE2结合物，于20℃孵育1h。取出，用洗液洗涤4次，立即加入150μLTMB底物，25℃孵育30min，用100μL1mol/L硫酸终止反应，在酶联免疫检测分析仪读取A450nm的值。每一标准品及样品均设置复孔，不加样品的孔用于调零。以检测缓冲液(培养上清)或裂解缓冲液(细胞裂解液)作为非特异性对照，以％B/B0(y轴)对PGE2浓度的对数值(x轴)作标准曲线，计算相关系数(r)为99％，求解回归方程，得出各样品中PGE2浓度的对数值。％B/B0的计算公式为：

　　标准品或样品的A值—非特异性对照的A值

　　％B/B0=()×100％

　　零标准品的A值—非特异性对照的A值

　　1.2.4MTT比色试验用2.5g/L胰蛋白酶消化单层培养细胞SGC7901，制备单细胞悬液。以每孔3×103个细胞接种于96孔培养板(每孔200μL)，分别加消炎痛(2，1，0.5，0.25及0.125μmol/L)或不加消炎痛，移入37℃50mL/LCO2孵箱中培养24h。然后每孔加入MTT溶液(5g/L)20μL，于37℃继续孵育4h，终止培养。吸弃孔中的培养上清，加入150μLDMSO振荡10min,

　　在酶联免疫检测分析仪测定A490nm的值。以只加培养液不加细胞的空白对照孔调零。

　　2　结果

　　2.1人胃癌细胞COX2mRNA的表达四株胃癌细胞的RTPCR产物经电泳分析，可见1条约232bp的扩增带，特异性好，阴性对照无相应条带出现(图1)。采用无血清培养基DMEM/F12培养后，仍有232bp的特异性扩增条带，只是条带的亮度稍下降(1.7与1.59)(图2)，说明胃癌细胞中有COX2基因的表达。同时，检测的另外4株细胞系亦有COX2基因的表达(图1)，但与正常肝细胞相比较，其表达水平稍弱。

人胃癌细胞中COX-2基因的表达及其生物学活性

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