胰腺癌的基因诊断研究现状

www.cnkang.com 2007-3-20 16:31:00 中华康网

　　摘要本文综述了目前可用于胰腺癌临床诊断的相关基因，认为K-ras基因及端粒酶基因最有诊断价值。K-ras基因在胰腺癌中的突变率为75%～100%，检测端粒酶活性诊断胰腺癌有100%的敏感性及特异性。尽管p53基因在胰腺癌中有一定的突变率，但单独用于临床诊断的意义不大。DPC4基因是新近发现的一种抑癌基因，在胰腺癌中的突变率约50%，有望进一步用于临床。临床上获取用于检测的标本，主要通过经皮细针穿刺活检、ERCP下刷检及收集胰液、插管收集十二指肠液、收集粪便或血液中的脱落细胞。

　　关键词：胰腺癌基因检测诊断

　　胰腺癌的发病率近几年明显增加，死亡人数也在上升。胰腺位于腹腔后壁，恶性病变发生较隐蔽，一旦临床发现，多数已失去了手术机会，因此迫切需要诊断早期胰腺癌的有效方法。目前临床上常用的CT及超声波难以诊断小于2cm的胰腺肿瘤，而CEA和CA19-9等传统的血清标志物往往在肿瘤发生转移后才升高[1]。分子遗传学的研究为胰腺癌早期诊断开辟了另一途径，本文仅对目前胰腺癌的基因诊断在临床上的应用现状作一综述。

　　肿瘤的发生是多阶段的复杂过程，涉及到多种癌基因的激活和肿瘤抑制基因的失活，胰腺癌也是如此。临床上可通过经皮细针穿刺活检或ERCP刷检等方式获取胰腺组织和细胞，收集胰液、十二指肠液、血液和粪便，检测其中癌相关基因。目前各国学者讨论较集中的胰腺癌相关基因是ras基因、p53基因、端粒酶基因及近两年发现的DPC4基因。

　　1 ras基因

　　目前认为ras基因是最常见的人肿瘤突变癌基因，在肺癌、结直肠癌及膀胱癌等肿瘤中，30%～66%可发生ras基因突变，而突变率在胰腺癌中最高，可达75%～100%[1]。

　　1.1 ras基因结构、功能和意义

　　ras基因家族由K-ras、H-ras和N-ras组成，编码蛋白质由188～189个氨基酸构成，分子量为21kD。该蛋白位于细胞膜的内表面，类似于已知的G蛋白，与GTP和GDP结合，具有GTP酶活性，它可能作为分子“开关”，以膜结合受体形式传递信号到细胞靶位。ras基因的激活能导致肿瘤发生，激活有多种形式，可以是表达增加，或是基因突变，或是内在的GTP酶活性下降，也可以是与GTP及GDP结合的亲和力降低，基因突变往往发生在12、13和61密码子，以12密码子最常见。

　　1988年，Almogarara等首先报道，采用RNA酶A错配切割法，检测了22例胰腺癌标本，结果K-ras基因的突变率高达95%，突变点均位于12密码子。此后Motojima和Yashiro对手术切除的胰腺癌标本进行K-ras基因分析，分别有88.6%和78.5%的突变发生率。Hruban汇总450例胰腺癌，平均K-ras突变率为78%。他指出：①由于K-ras基因的点突变基本上局限在12密码子，故应用有限数量的探针就可测出这些突变。②胰腺癌有很高的K-ras突变率，K-ras可作为判断胰腺癌存在的敏感标记物。③K-ras突变存在于胰腺原位癌，因此可用于早期诊断[2]。

　　1.2 k-ras临床检测

　　1.2.1 经皮细针穿刺活检组织检测K-ras基因

　　tada等[3]在B超引导下细针穿刺获取胰腺细胞，采用PCR扩增测序法检测DNA，结果12例胰腺癌病人皆发现有K-ras基因12密码子突变，而6例慢性胰腺炎病人均阴性。王志永等用PCR-RFLP技术检测了27例细针穿刺活检组织，经病理和（或）手术确诊，结果15例胰腺癌中14例（93%）有K-ras突变，1例假阴性，12例非胰腺癌病人均阴性。临床上对疑有胰腺癌者行经皮细针穿刺，检测K-ras基因，特别是PCR-RFLP方法的检测物为DNA片段，需微量标本即可，操作简便、快速，故可用于临床上胰腺癌的诊断。

　　1.2.2 收集胰液及十二指肠液检测K-ras基因

　　k-ras基因突变仅存在于胰导管源性肿瘤，肿瘤细胞脱落后可经胰液排出，故收集胰液可检测到K-ras突变。1993年Tada等[4]于注射促胰素后在ERCP下收集胰液，结果6例胰腺癌全部有K-ras突变，1例胆石症及2例慢性胰腺炎均阴性。后来，Berthelemy[5]也测到83%的K-ras突变率。Iguchi[6]则用Dreiling管收集十二指肠液，采用单链构象多态性分析法（PCR-SSCP）测出K-ras突变率为63%，用此方法收集胰液简单易行，PCR-SSCP技术简单、较敏感，阳性率又明显高于传统的细胞学检查，较适用于胰腺癌的早期诊断。

　　1.2.3粪便中检测脱落细胞K-ras基因

　　也可依靠粪便中出现突变K-ras来诊断胰腺癌。粪便中突变K-ras主要源于排入肠腔的胰液中所含有的肿瘤细胞。Caldas等[7]采用斑点杂交技术检测11例胰腺癌病人的粪便，有6例出现K-ras点突变，与直接收集胰液相比，粪便中突变K-ras阳性率相对偏低，但由于简单易行，可望用于胰腺癌的普查。

　　1.2.4血液中检测K-ras基因

　　当胰腺癌发生血行转移时，在外周血中可测到K-ras突变。有报道用PCR技术检测6例胰腺癌的外周血，其中3例有转移癌细胞者出现了K-ras基因突变[4]。而2例胰岛素瘤病人的外周血中无K-ras突变[4]。故认为此法有助于检测胰腺癌有无血行转移。

　　1.2.5 eRCP刷检物检测K-ras

　　1995年，Apple等[8]检测了60份ERCP下刷检物进行细胞学检查，经临床随访证实，46例胰腺癌中有44例（95.7%）K-ras基因12位点突变，而12例胰腺良性病变及2例胰岛细胞瘤均阴性，认为此法可弥补形态学上的诊断困难，尤其是标本量偏少时尤为适用。

　　有研究者[9]在ERCP下对胰管造影见有主胰管狭窄的45例患者进行刷检，检测刷检物K-ras突变并与传统的细胞学涂片进行比较，结果发现胰腺癌有83%（20/24）的K-ras突变率，16例慢性胰腺炎及5例胰管内粘蛋白高分泌瘤均阴性。尤其重要的是，其中6例肿瘤直径≤2cm的胰腺癌有K-ras突变，而细胞学检查的阳性率只有54%。可以看出，ERCP下刷检物K-ras突变检出率明显高于传统细胞学检查，并且K-ras突变发生在胰腺癌早期，更有利于临床早期诊断。

　　也有少数良性胰腺疾病发生K-ras基因突变的报道，Tada等[10]观察到，79份胰管粘液细胞增生灶有19份（24%）出现K-ras突变，而16例正常胰管无一例出现K-ras突变，30份胰腺癌均阳性；Yanagisawa等[11]发现，由慢性胰腺炎引起的胰管粘液细胞增生K-ras第12密码子突变率62.5%（10/16）。他们推测这些良性病灶可能属于癌前突变，是否如此，尚有待于进一步研究。

　　大多数报道认为，K-ras基因突变与胰腺癌预后、分期无关，但可能与转移有关。Motojima等[12]检测了57例病人胰腺癌组织的K-ras突变，发现Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期的肿瘤K-ras突变率分别为100%（1/1）、100%（5/5）、85%（17/20）、85%（23/27）；癌灶直径≤2cm、2.1～4.0cm、4.1～6.0cm、≥6.1cm的病例K-ras突变率分别为100%（1/1）、89%（17/19）、90%（19/21）和75%（3/4）；肿瘤无淋巴结转移、近处转移和远处转移K-ras突变率分别为87%（13/15）、85%（17/20）和100%（10/10）。

　　2 p53基因

　　p53基因是一类重要的肿瘤抑制基因，与多种肿瘤的发生有关。有人总结了2567例肿瘤，37%有p53基因突变，其中胰腺癌突变发生率为44%。

　　2.1 p53基因结构、功能和意义

　　1979年，Lave等人在转化细胞的提取物中首次发现p53基因，以后证实其位于17号染色体短臂，全长约20kb，由11个外显子及10个内含子组成，编码蛋白分子量为53kD。p53是一个重要的细胞增殖周期调节因子，当p53基因突变和功能丧失时，p53介导的细胞周期调节失控，DNA合成程序紊乱，发生遗传不稳定性及多倍性，也可能使p53介导的凋亡丧失，导致肿瘤发生。

　　2.2临床检测

　　检测方法主要有：①DNA测序法；②PCR-SSCP法，此法的敏感性及特异性均在90%左右；③免疫组化法，此法的敏感性为75%，阳性预测值为63%。由于p53基因存在于人类多种肿瘤中，而且p53基因在5、6、7、8及其他外显子均可能发生突变，临床上用分子生物学技术检测这些突变既耗时又耗力，故大多数人主张用免疫组化法检测p53基因产物——p53蛋白。正常细胞的p53蛋白半衰期极短，表达水平低而检测不到，当p53基因突变时，其蛋白产物在核内堆积，p53呈高表达，即阳性发现。Barton等检测了22例胰腺癌标本，有13例（60%）p53蛋白阳性，Digiuseppe等检出40%的胰腺癌组织有p53蛋白的过度表达，因此认为，p53基因的改变在胰腺癌发生中有重要作用。

　　p53基因突变存在于多种肿瘤中，且在胰腺癌中的突变率远低于K-ras，某些良性胰腺病也可出现阳性，故作为基因标志物单独用于胰腺癌的诊断意义不大。Maacke等[13]报道，15例胰腺癌及27例胰腺炎病人的胰液中，p53蛋白阳性率分别为67%及59%，两者相差不显著，认为在慢性炎症过程中p53过度表达可能由于DNA损害所致。正常及突变的p53蛋白释放入血后，刺激B淋巴细胞产生抗p53蛋白的自身抗体。有人探讨了血中p53蛋白的自身抗体测定，结果发现，胰腺癌中阳性率为18.2%，急性胰腺炎为5.3%，慢性胰腺炎中为12.1%，三者之间差异不显著。

　　一些研究表明，p53蛋白的过度表达似乎与胰腺癌预后有关，但遗憾的是，报道的结论不一致。多数学者的研究结果为：p53蛋白阳性的胰腺癌病人预后较差，生存期短。有人观察到p53蛋白阳性的胰腺癌病人生存期只有10个月，而阴性者为20个月，Linder[14]等的报道也支持这个结论，但Dergham[15]发现p53蛋白阳性的胰腺癌病人的生存期(12.8个月)较阴性者长（10.5个月），各家报道结果矛盾的原因有待于进一步探讨。

　　3 端粒酶

　　端粒是真核生物线性染色体末端的一种特殊结构，由简单重复且富含鸟嘌呤的DNA序列及相关蛋白组成。人和各种脊椎动物的端粒DNA序列都为（5’-TTAGGG-3’）n，近来研究表明，它与细胞的寿命控制有着密切联系。端粒长度的维持需要端粒酶的激活，端粒酶是含RNA模板的核糖核蛋白，以自身RNA为模板合成端粒重复序列。含有这种活性酶的细胞可逃避进行性端粒缩短而获得无限制的生长潜力。在大部分正常人体细胞中没有端粒酶的活力，而在肿瘤细胞中端粒酶却特异性表达。

　　1994年，Counler等发现端粒酶活力仅存在于腹水转移卵巢癌中，而在正常卵巢上皮组织中缺乏，开始认识到端粒酶在肿瘤发生发展中的重要性，以后人们逐渐发现，94%神经母细胞瘤、93%乳癌、80%肺癌、85%肝癌、100%卵巢癌、85%胃癌、84%前列腺癌和75%肾癌中端粒酶阳性，而在邻近正常人体组织细胞或良性肿瘤组织中则多为阴性。Hiyama等[16]测定了胰腺癌手术切除标本后再行胰管刷检物中的端粒酶活性，发现9例胰腺癌均阳性，而3例囊腺瘤及1例慢性胰腺炎均阴性。由此看出，检测端粒酶活性诊断胰腺癌有100%的敏感性及特异性。推测如能在内镜下取材进行端粒酶的测定，此方法将是诊断胰腺癌的又一新途径。

　　4 联合检测

　　为提高胰腺癌诊断的敏感性和特异性，有人尝试同时检测两种或多种癌相关基因。最常见的组合是以K-ras为主，再辅以其他基因。Dergham等[15]在76例胰腺癌的病理标本中，同时检测K-ras突变及p53蛋白表达，结果单有K-ras突变率为72%，单有p53表达率为43%，两者都阳性者为31%，至少有一种阳性者为84%，表明同时检测可提高阳性率。他们还发现两种突变同时存在与单独存在相比，在肿瘤分级、分期、存活期上均无明显差别。Surgio等[17]在115个正常、未侵袭病灶、已侵袭病灶中同时观察K-ras突变及5q、18q染色体杂合性丢失（LOH），发现K-ras突变发生于胰腺癌发病的早期，突变部位是多灶性的，这为用于临床早期诊断提供了依据。5q、18q染色体LOH则是胰腺癌相对晚期的现象，其中5q染色体是APC基因所在区域，18q染色体则是DCC及DPC4基因所在区域。

　　5 dPC4基因

　　dPC4（deleted in pancreatic cancer 4）基因是近年来新发现的一种新的肿瘤抑制基因，编码蛋白是TGF-β传递信号到细胞内途径的一个成员，而TGF-β则抑制许多细胞的生长，所以DPC4的丢失可促使细胞过度生长[18]。新近研究发现，P21wafl可能参与这个过程的发生[19]。1996年，Hahn[20]报道，在18q21、1上发现DPC4基因，并测得约50%的胰腺癌有DPC4的丢失或失活，其中约30%为纯合性丢失，约20%有点突变，认为DPC4基因的改变可能与胰腺癌的发生有关。DPC4基因改变在膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、卵巢癌及神经系肿瘤发生率较低，而在食道癌、胃癌及与溃疡性结肠炎有关的肿瘤中未发现DPC4的改变[21]。因此，DPC4基因的丢失或失活有望成为胰腺癌的新基因标志物。

　　6 其他

　　与胰腺癌发生有关的基因还有APC、DDC、Rb-1、C-erbB2、nm23等，因这些基因在胰腺癌中的表达率远不如K-ras高，故不能单独作为胰腺癌基因用于诊断。

　　参考文献

　　1 dutty MJ. Clin Chem,1995;41:1410～1413

　　2 hruban RH. Am J Pathol,1993;143:545～553

　　3 tada M et al. Gastroenterology,1991;100:233～238

　　4 tada M et al. Cancer Res,1993;53:2472～2474

　　5 berthelemy P et al. Ann Intern Med,1995;123:188～191

　　6 iguchi H et al. Gastroenterology,1996;110:221～226

　　7 caldas C et al. Cancer Res,1994;54:3568～3573

　　8 apple SK et al. Am J Clin Pathol,1996;105:321～326

　　9 lanthem JLV et al. Gut,1995;36:781～787