心肌梗塞病患者红细胞膜粘弹性的实验研究

　  本文采用微管吸吮实验技术研究了正常健康人与心肌梗塞患者红细胞在吸进微管的变形过程，采用二维Kelvin模型拟合实验结果，定量地比较了正常人与心肌梗塞患者红细胞膜的粘弹性，结果表明：心肌梗塞患者红细胞膜的弹性模量(5.72±1.77)×10-1dyn/cm)与正常人((5.36±0.56)×10-1dyn/cm)无十分明显差异，而粘性系数((4.39±1.72)×10-4dyn．s/cm)明显高于正常健康人((1.91±0.96)×10-4dyn．s/cm)红细胞粘滞性增大，变形能力降低，这可能正是造成患者心肌供血不足，以致梗塞的主要因。

　　分类号： 　R318.01; R331.1+41

EXPERIMENTAL STUDIES ON VISCOELASTIC PROPERTIES OF

　　ERYTHROCYTE MEMBRANE OF MYOCARDIAL INFARCTION

Li Zishuang, Huang Lan

　　(Physics Department of Guangxi University, Nanning 530004)

　　Zhang Xianquan

　　(Mathematics Department of Guangxi Teachers University, Guiling 541004)

　　Cai Shaoxi,Wu Yunpeng

　　(Bioengineering Institute of Chongqing University, Chongqing 400044)

ABSTRACT

　　The deformation of a portion of erythrocyte during aspiration entry into a micropipette was analyzed, the experiment results was worked out by two-dimensional Kelvin model, and the viscoelastic properties of erythrocyte membrane of the myocardial infarction patients was quantitatively compared with those of the normal people. The results showed that the erythrocyte membrane elastic modulus of myocardial infarction patients(5.72±1.77)×10-1dyn/cm was almost the same as that of the normal people(5.36±0.56)×10-3dyn/cm), but the erythrocyte membrane viscosity of the myocardial infarction patients(4.39±1.72×10-4dyn．s/cm) was significantly higher than that of the normal people(1.91±0.96×10-4dyn．s/cm)dyn/cm). The deformation of erythrocyte of myocardial infarction patient was reduced and the viscoelasticity increased. These changes caused the blood supply insufficient and myocardial infarction.

　　Key words:　Myocardial infarction; Erythrocyte membrane; Elastic modulus; Viscosity; Micropipette aspirate

　　0　引 言

　　红细胞力学性质的最大特点是它能够在保持其表面积恒定或变化很小的情况下发生很大的变形。这使得红细胞在通过微血管时可发生各种形状的变形，以保障微循环的畅通，又不因此而减小其与外界进行气体交换的面积，保证新陈代谢正常进行。不论红细胞在微血管中的变形如何显著，一旦进入大血管或处于静止状态，则可在很短的时间内恢复原状。这说明红细胞可以看作是一弹性体，弹性越好，变形能力越强。但红细胞的弹性只表现在有效的应力范围内，在较广的应力范围内，红细胞是既有弹性，又有粘性的粘弹性体，甚至在极高的应力下表现出粘塑性的特征［1］。

　　红细胞膜的生物物理特性在细胞的各种特性中起着十分重要的意义，而由于红细胞相对容易收集［2，3］，所以我们常用红细胞膜作为研究膜的生物物理特性的模型，由于它们在健康和病理的血液流动中起重要作用。所以，红细胞膜的粘弹性是我们特别感兴趣的领域。微玻璃管吸吮实验技术是本世纪70年代中末期开始发展起来的一种研究单个细胞或细胞对的变形和粘附的重要手段［4，5］，它是用一根直径很细的微管采用负压，把细胞膜的一部分吸进管内。从实验中可以测出被吸入部分长度，以吸入长度和负压的相应关系来分析计算出红细胞膜的弹性系数和粘性系数，以说明膜的力学特性和细胞间的相互作用。由于红细胞结构的简单性及变形过程的典型性，愈来愈多的学者采用包括微管吸吮技术在内的多种手段，在红细胞变形的时间过程、理论模型等方面进行了大量的研究［1，5］。本文采用微管吸吮技术，定量地讨论了心肌梗塞病患者红细胞膜的粘弹性。

　　1　微管吸吮实验器材及方法

　　1.1　试剂

　　PBS液(NaCl,13.7931g;Na2HPO4·12H2O,15.2681g;KH2PO4,1.3609g;蒸馏水，2000ml;pH7.4，用2μm滤膜过滤)，0.9%生理盐水，10%的NaOH溶液。

　　1.2　试样

　　心肌梗塞病患者20例：50～70岁，均为男性，由重庆市中医研究所提供；正常对照组血液10例：50～65岁，均为男性，由重庆市中医研究所提供。

　　1.3　器材

　　烘箱及消毒蒸锅，小腔室(Chamber),油镜(100/1,30)，拉针器(SUTTER INSTRUMENT CO.U.S.A MDEL P-87)，显微镜(GLIB2-74WB)，计算机监视系统，(CONTRON ELECTRON IC VIDAS)，倒置显微装置(OPTON AXLDVERT 35)，微操作器(配套)(EPPEND ONF MICROMANIPULATOR 5110)，光源，压力系统(计算机、步进电机)，微量注射器，微玻璃管(中科院上海脑研所)。

　　1.4　实验方法

　　1.4.1　微管准备

　　调整拉针器内部程序，直至将管子拉制直径为1.8μm左右的微管，要求管尖平整光滑，变化梯度不宜太大。制好的微管中用微量注射针灌满过滤的PBS液，在光学显微镜下观察，要求不得有任何一个小气泡或杂质夹在管内。

　　1.4.2　压力系统准备

　　压力系统内液为0.9%的生理盐水。排出管道中的所有气泡，将充满液体的微管装在夹针头上，其管口大的一端和压力系统相联，再经过夹针头固定于微操作器上。压力通过计算机控制步进电机，以调整两个玻璃瓶高度差来实现。实验过程中，只要操作计算机就可自动得到预想的压力值(调整压力时，先和微管处切断)。

　　1.4.3　红细胞准备

　　从受试者静脉抽取血液1ml，肝素抗凝混合均匀。离心5min，转速2000rpm，倾去血清及白细胞等悬浮物，用PBS液洗涤3次，最后配成一定浓度的红细胞悬浮液。

　　1.4.4　红细胞在微管中的变形和恢复过程

　　打开光源，将灌好PBS液的针在微操作器上装好，并调节零点压力，使管内外压力平衡，将准备好的血样悬液约0.5ml注入一特定圆形小腔(Chamber)内，置于倒置显微镜操作平台上，放在油镜上观察，图象同时通过摄像镜头、录像机、监视器相联，记录实验中红细胞变形，其结构框图如图1。

图1　微管吸吮系统结构框图

　　特别小心地操作微操作器，先使微管进入小腔室(Chamber)，再慢慢调整，使管尖和Chamber内的细胞处于同一平面上，并且使微管位置处在监视屏中。调整零位压力器，使管尖处细胞不吸入微管，也不被吹移离开微管，此时零位调节完毕。关闭零位调节器和微管处的压力开关，接通零位调节器和连接瓶的压力，将压力置于预想值，同时打开微管处的压力开关和记录键，记录细胞吸进微管过程，摄制完后，轻放压力，准备另一个细胞的吸吮过程。所有实验均在20℃左右进行，约4h完成。

　　1.4.5　计算与统计分析

　　在微管吸吮试验中，红细胞变形分析是基于在一个无限大平面上，红细胞膜的一部分被吸入到半径为Rp的管子里，并假定在红细胞膜变形的每一时刻均处于动态平衡状态，膜张力在管口边缘连续，管口摩擦力可忽略不计。

　　参照Chien等半球状帽子模型理论［5］，用Kelvin模型拟合实验结果，该模型由一个模量为μ的弹性元件和一个系数为η的粘性元件并连而成。设在t时刻红细胞膜被吸进微管长度为Dp，在2s的记录时间内所达到的最大长度为Dpm，则有［5］：

(ΔP)Rp/μ=2Xm-1+Ln(2Xm)(1)

　　τ=-a/｛4［dLn(Dpm-Dp)/dt］｝(2)

　　η=μτ(3)

　　式中，ΔΡ为所施加的阶跃负压，Rp为微管内半径，Xm=Dpm/Rp,τ为所记录变形过程的时间τ常数，a为在区间［1,Xm］内(1)式线性拟合所得的常数。

　　即：

(ΔP)Rp/μ=2Xm-1+Ln(2Xm)=aX+b(4)

　　方程(4)被拟合为［5］：

a=2.45,b=-0.603

　　∴　τ=-1/［1.633d(LnDpm-Dp)］dt(5)

　　由以上5式计算求得弹性模量μ，时间常数τ和粘性系数η作为表征红细胞粘弹性的客观物理量。

　　统计处理采用两样本均数的t检验。

　　2　实验结果及讨论

　　2.1　微管吸吮红细胞的动态过程记录

　　电视摄像记录系统的图象通过回放入图象处理系统测出其吸入长度Dp，管子内径Rp，确定各点的时间及对应的压力值。图2是一个典型的患者红细胞在一定阶跃压力作用下在微管里变形的时间序列图。

　　2.2　红细胞膜的弹性模量

　　在稳定的状态，Dp最大值定义为Dpm(Dpm是吸吮压力，微管内径Rp及红细胞膜弹性模量μ的函数)，从使用不同ΔP和Rp得到稳定状态的应力应变数据，从而得到无纲量的变形参数Dpm/Rp和ΔP(Rp)关系图。在图3中为患者血样的Dpm/Rp和ΔP(Rp)关系图，两曲线分别为理论曲线和实测数据。

　　结果表明：当Dp/Rp≥1时，Dpm/Rp和ΔP(Rp)几乎成线性关系，在每一点上都可比较Dm/Rp和ΔP(Rp)而得到μ。通过计算，我们可以得到不同血样下细胞膜的弹性模量。

图2　患者红细胞在一定阶跃压力作用下在微管里变形时间序列图

图3　稳定状态，无量纲变形量

　　Dp/Rp和ΔP(Rp)关系图

图4　红细胞变形过程中无量纲量吸入长度

　　Dp/Rp对无量纲量(t-t1)/τD1的关系图

　　2.3　加载期间红细胞膜的粘弹性

　　在微管吸吮实验中，红细胞在微管中的整个变形分为两个阶段。第一阶段是快速的变形过程，通常短在1s之内，接着，变形缓慢进行到最后状态Dpm(大约时间20s左右)。由于整个变形的95%以上发生在第一阶段，故我们考虑快速变形过程。

　　由方程(5)，我们可得到快速变化的时间常数τm:

τm=-1/｛1.633dLn(Dpm-Dp)/dt｝

　　取Dp/Rp=1,τD则为τD1。τD1随Dpm/Rp变化而变化。

　　为了消除管径初始时间影响，采用Dp/Rp来表征吸入长度，用(t-t1)/τD1来表征时间，二者都为无量纲量，则Dp/Rp与(t-t1)/τD1的关系图，表示了红细胞的变形过程这一动态过程，同时亦表征了红细胞的变形能力(见图4)。快速变化阶段红细胞膜的粘性系数计算为：

ηD1=μτD1

　　表1为实验数据计算所得的红细胞膜的弹性模量，粘性系数，表中同时给出了各组细胞的几何尺寸及变形过程的时间常数。

表1　心肌梗塞患者及正常人红细胞膜的弹性模量，粘性系数，时间常数及几何尺寸

　 d(μm) μ(10-3dyn/cm) η(10-4dyn·s/cm) τ(Sec)
正常人 1.10～1.30 5.36±0.56

　　n=20
 1.91±0.96

　　n=20
 0.018±0.006

　　0.005～0.034
 
患　者 1.04～1.30 5.27±1.77

　　n=40
 4.39±1.72+++

　　n=40
 0.045±0.016++

　　0.012～0.106
 

　　d：微管内径；与正常人比较：+++P＜0.001,++P＜0.01

3　讨论

　　微管吸吮实验使我们能动态地定量地分析红细胞在阶跃负压下吸吮进微管的变形过程及在撤消阶跃负压时的恢复过程。在吸吮过程中，大部分变形发生在初始阶段(即快速变化阶段)，大约在1s以内，1s以后变形缓慢，大约在20s后达到稳定状态，不再发生变形。快速阶段的时间常数τD1与无量纲量吸吮长度(Dm/Rp)成反比。τD相对应，由于η=μτD，所以，在快速变形阶段红细胞膜的粘性系数(ηD1)亦与(Dpm/Rp)成反比。提高(Dm/Rp)意味着提高无量纲量压力参数ΔP(Rp)/μ(见图2)。表明随着应变率提高，红细胞膜粘性系数随之下降。

　　红细胞变形性是红细胞重要的流变特性之一，它取决于红细胞的粘弹性，红细胞内粘度以及由红细胞表面积/体积的比值及红细胞的几何形状。以微管吸吮技术定量地区别反映影响红细胞变形的诸多因素时，一个重要条件是所用的微管内径控制。使用微管内半径若在0.5～1μm，则实验结果基本上反映红细胞膜的粘弹性，而如果使用的内径接近3μm，则实验结果主要反映红细胞表面积/体积的相对关系。我们实验所使用的管内半径在1μm以内，基本上反映了红细胞膜的粘弹性。弹性模量是指产生非轴向伸展所需的力，其值愈大，表明硬度愈大。粘性系数指的是细胞膜受力发生变形反应或外力撤消后形成的恢复时间依赖性，所需时间越长，其表面粘性系数愈大。实验结果表明：心肌梗塞患者血样红细胞粘性系数明显高于正常人，说明患者红细胞滞性增大，变形性降低。这也正是患者客观流变学指标测定中的粘度及粘弹性明显高于正常值的原因之一。其粘性系数的增高还可能与细胞膜有关［6，7］。而患者的红细胞膜弹性模量和正常红细胞比较无明显差异，其原因还待进一步研究，对恢复期的细胞粘弹性亦可作进一步研究。

　　细胞力学的研究是当前生物力学研究中的前沿课题之一，我们的研究是在前人基础上作了一些工作，还存在许多问题需要进一步解决，在建立微管吸吮实验的理论模型中，没有考虑细胞膜与微管间的摩擦力。而且本文的分析是采用了小变形模型来分析细胞的力学特性，事实上在实验中，细胞在微管内可以测量的变形相对于初始形已经较大，小变形理论只能是一种近似的分析实验数据的简单方法。由于细胞的实际变形往往较大，无论是被动变形还是主动变形，所以应进行大变形分析，需进一步引入生理的边界条件，建立更完善的细胞变形模型。

4　参考文献

　　1，Chabanel. A, et al. Viscoelastic properties of red cell membrane in hereditary elliptocytcosis, Blood, 1989,73(2):592～595

　　2，Sato M, et al. Application of the micropipette technique to the measurement of cultured aortic endothelial cell viscoelastic properties. J Biom Eng,1990,112:263～268

　　3，Evans EA. A new material concept for the red cell membrane. Biophys J B,1973,13:926～940

　　4，Evans EA. Hochmuth KM. Membrane Viscoelasticity. Biophys J,1976,16:1～11

　　5，Shu Chien, Sung KL, Skalak R, et al. Theoretical and experimental studies on viscoelastic properties of erythrocyte membrane. Biophys J,1978,24:463～476

　　6，Evans EA. Intrinsic material properties of the erythrocyte membrane in dicated by mechanical analysis of deformation. Blood,1975,45:29～43

　　7，Cohen Carl M. The molecular organization of the red cell membrane skeleton. Seminars in Hemntology, 1983,20(3):141～145