人成骨肉瘤细胞系SOSP-9607的建立及其生物学特性的观察

　　【摘要】　目的　建立人成骨肉瘤细胞系。方法　采用原代组织块培养法对成骨肉瘤手术标本进行培养，对存活细胞进行形态学观察、组织化学染色、乳酸脱氢酶(LDH)同工酶谱、细胞周期检查、核型分析、异种移植。结果　建立细胞系SOSP-9607，其形态学表现、组织化学染色、LDH同工酶谱等均符合成骨肉瘤的特征。经1年体外培养，已连续传代120次，细胞倍增时间29.8h，细胞周期测定G1期为48.2%、G2期为20.9%、S期为30.9%。染色体具有亚三倍体核型，众数为64～66条。异种移植成瘤率100%，无支原体污染。结论　人成骨肉瘤细胞系SOSP-9607可用于对成骨肉瘤的研究。

　　Establishment and biological characters of a human osteosarcoma cell line SOSP-9607

　　YANG Tongtao, FAN Qingyu, ZHANG Dianzhong, et al.

　　(Department of Orthopaedics, The Second Affiliated Hospital, The Forth Military Medical University, Xi'an 710038,China)

　　【Abstract】 Objective To establish a human osteosarcoma cell line.Methods The specimens which were identified as osteosarcoma were cultured primarily in vitro. The surviving cells underwent morphological observation, histochemical staining, isoenzyme pedigree (LDH) determination, cell cycling analysis, karyotype analysis and heterotransplantation.Results The newly established cell line SOSP-9607 was maintained in continuous culture for over 120 transfer generations in 1 year. Morphological observation, histochemical staining and LDH isoenzyme pedigree revealed that SOSP-9607 had the common features of osteosarcoma. The cell cycle analysis showed:G1 48.2%, G2 20.9%, S 30.9%. The doubling time of cells was about 29.8 h. The chromosome analysis showed a hypotriplaid feature with a model number of around 64～66. The cells remained free off mycoplasma and the tumor formation ratio of heterotransplantion was 100%.Conclusion The SOSP-9607 appeared to be a cell line derived from human osteosarcoma cells and could be used as a model for further study on osteosarcoma.

　　【Key words】 Sarcoma, osteogenic; Cell line; Karyotyping　　我们新建立1株人成骨肉瘤细胞系SOSP-9607，体外已传120代，可用于对成骨肉瘤的研究，现将其建系过程及其生物学特性报道如下。材料与方法

　　1.组织来源、建系：男性17岁患者，1996年7月16日因左胫骨上段成骨肉瘤行左大腿高位截肢术，截肢标本取材，病理诊断成骨肉瘤(软骨母细胞型)。肿瘤标本用Hanks液冲洗数次。剪成直径1mm左右的小块后，再反复冲洗，贴壁接种于培养瓶底，底面朝上，同时加入含体积分数为20%小牛血清及常规量青、链霉素的RPMI 1640培养液4ml，置37℃培养箱内，2h后缓慢将培养瓶翻转。3d后见有细胞晕生长，定期半量换液，反复清除成纤维细胞。1月后1∶2传第1代。此时细胞处于一个生长相对缓慢期，半个月后传第2代。至第4代时，细胞渐迅速生长，以后4～5d传代1次，至1997年9月，细胞已传120代，性质稳定。冻存复苏后，台盼蓝拒染活细胞在90%以上。

　　2.细胞形态：将生长于盖玻片上的单层细胞以体积分数为95%乙醇固定，行HE染色，光镜观察。另将细胞以体积分数为2.5%戊二醛固定，常规方法处理，行扫描和透射电镜观察。

　　3.生长特性：取第44代细胞培养测定生长曲线、倍增时间、分裂指数、贴壁率［1］。

　　4.组织化学染色：将不同代数的细胞培养于盖玻片上，体积分数为95%乙醇固定，进行碱性磷酸酶(钙钴法)、酸性磷酸酶(刘氏法)染色及阿新蓝-PAS染色法显示胞浆中酸性、中性粘多糖。

　　5.免疫组织化学染色：应用抗成骨肉瘤单克隆抗体2G10(本室范德刚医师提供)，对生长于盖玻片上的单层细胞(体积分数为95%乙醇固定20min)、移植瘤切片进行免疫组织化学染色，光镜观察［2］。

　　6.乳酸脱氢酶(LDH)同工酶测定：取对数生长期的第65代细胞3×106个，磷酸盐缓冲液(PBS)中制成悬液，反复冻融，收集上清，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸黄素-N-甲基吩嗪甲基硫酸盐-氯化硝基氮唑蓝(NAD-DMS-NBT)染色显带扫描定量。

　　7.细胞周期测定：消化收集第87代细胞，PBS洗涤制成2×109个/L细胞悬液，冰冷乙醇固定，碘化丙啶染色，流式细胞仪上行细胞周期分析。

　　8.染色体分析：取第80代细胞按常规方法处理［3］，G显带后进行核型分析。

　　9.裸鼠移植：取第78代细胞5×106个/只，分别接种于8只Bal b/c裸鼠右臀皮下，3周后处死裸鼠，取移植瘤，固定后做光镜、电镜观察。

　　10.支原体检查：不同代数的细胞培养于盖玻片上，Hoechst-33285荧光染料染色，荧光显微镜下观察。

　　结　　果

　　1.细胞形态：相差显微镜下见细胞呈上皮样细胞排列，单层贴壁生长，有重叠生长现象。除处于有丝分裂阶段和衰老退变的细胞外，以多边形、三角形细胞为主，占94%～95%，其次是多核巨细胞。HE染色见胞浆轻度嗜碱，核大，核浆比例异常，可见较多分裂相。透射电镜示胞浆内较多粗面内质网，囊池有不同程度的扩张。线粒体、高尔基体、核糖体清晰可见，线粒体有不同程度的退变，如肿胀、空泡化等。细胞核大，核膜呈皱折状凹陷，核仁大。扫描电镜下见细胞表面满布微绒毛，有多个粗细不等的树枝状、丝状伪足。支原体检查为阴性。

　　2.生长特性：3.05×105个/瓶细胞浓度接种，第6d达到高峰。分裂指数为33‰。细胞倍增时间为29.8h，贴壁率4h为89.5%，8h为91.5%。

　　3.组织化学染色：显示碱性磷酸酶(AKP)染色胞浆内弥漫着色，胞膜也有着色。酸性磷酸酶(ACP)染色为阴性。酸性及中性粘多糖染色部分细胞呈阳性。

　　4.免疫组织化学染色：见肿瘤细胞胞浆内有阳性棕色颗粒，弥漫存在，粗细不一，反应越强，颗粒越粗。

　　5.同工酶谱：共5带。LDH同工酶相对含量百分数：LDH1为12.7%，LDH2为26.7%，LDH3为36.3%，LDH4为21.7%，LDH5为2.6%。

　　6.细胞周期分析：G1期为48.2%，G2期为20.9%，S期为30.9%，G2/G1=1.884。

　　7.染色体分析：分析100个细胞，其染色体数目波动在56～67条，变化涉及各组，以B、C、E组增加较为明显。染色体干系数目为64～66，占81%，为亚三倍体核型。分析50个核型，可识别的共有标记染色体为：der(1)t(1;3)(q11:q11)； del(3q)，部分核型可见t(5;10)(q11:q11)、t(7；8)(q22:q24)及双着丝粒、环状染色体和微小体等异常改变。

　　8.裸鼠移植：接种后1周，即可见移植瘤长出。8只裸鼠全部成瘤，移植瘤呈结节状，与皮肤有粘连。光镜下形态与原肿瘤相似，电镜下细胞形态与培养的SOSP-9607一致。

　　讨　　论

　　我们建立的SOSP-9607细胞系为上皮样细胞，多数为多边形、三角形，单层贴壁生长，有重叠生长现象，可见多核巨细胞及有丝分裂相。细胞核大，核浆比例异常。增殖迅速，染色体为亚三倍体型，有多种染色体异常表现。裸鼠移植成瘤率100%，符合恶性肿瘤细胞特征。该细胞系LDH同工酶谱中，LDH3活性最高。作为鉴别成骨肉瘤重要依据之一的肿瘤细胞碱性磷酸酶染色呈阳性反应。抗成骨肉瘤单克隆抗体2G10染色阳性。经过1年体外培养，连续传代120次，表明SOSP-9607是1株新建成的成骨肉瘤细胞系。其特点是：性质稳定，增殖迅速；裸鼠移植成瘤时间短，成瘤率100%；染色体集中在64～66条，占81%，各群染色体均有增多，以B、C、E组最为明显，der(1)t(1;3)(q11:q11)和del(3q)2种染色体改变检出率为100%，是本细胞系最有意义的标记染色体。该细胞系的建立，为成骨肉瘤的研究提供了新的实验材料，为揭示成骨肉瘤发生、发展、转移等规律提供了一个实验模型。

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目(39330200)

　　参考文献

　　1，司徒镇强，吴军正，王为，等.人粘液表面样癌细胞系MEC-1的建立及其生物学特性.实用口腔医学杂志，1990，2：83-85.

　　2，范德刚，范清宇，裘秀春，等.抗骨肉瘤单克隆抗体2G10与骨源性肿瘤组织的免疫组化反应研究.细胞与分子免疫学杂志，1997，2：29-32.

　　3，刘权章，主编.人类染色体方法学.第1版.北京：人民卫生出版社，1992.