培养的星形胶质细胞反应性胶质化的研究

　　我们利用分离培养的星形胶质细胞(astricyte, ast)建立体外反应性胶质化模型，并在此基础上研究损伤Ast反应的发生、发展及其特点。

　　一、材料与方法

　　新生当天大鼠，取皮层组织常规制成细胞悬液，转入含胎牛血清的DMEM培养瓶中，37℃、体积分数为5%CO2孵箱培养24 h，细胞贴壁后换液。待细胞生长至约80%融合后，质量分数为0.25%胰酶消化细胞、传代，重复传3～4代，Ast纯度超过95%。

　　将Ast消化后接种在经多聚赖氨酸处理的盖玻片上24孔板中，Ast生长达80%～90%融合后，用无菌血管钳夹持自制消毒橡皮头，在盖玻片上不同部位轻轻点搓3～4次，造成Ast损伤。用D-Hank's液清洗培养物，去除损伤的细胞碎片，补加新鲜培养基继续培养，倒置相差显微镜下观察Ast对损伤的反应。

　　提取细胞总RNA，将细胞总RNA中的mRNA逆转录成cDNA，取适量产物进行聚合酶链(PCR)反应。设计合成引物2对，胶原纤维酸性蛋白(GFAP)引物上游序列为5′CTGAATTCTGCT-GGCTTCAAGG-3′，下游序列5′-CTAA-GCTTGCTCTGCGTTGCGG-3′，扩增片断长624 bp。β-actin引物上游序列为5′-GCGGGAAATCGTGCTGACATT-3′，下游序列为5′-GATGGAGTTGAAGGTAGTTTCGT-G-3′，扩增片段长314 bp。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测，长波紫外灯下观测并照相，以β-actin作为内对照，紫外分光光度计分析目的基因的表达。

　　取生长于盖玻片上的正常与损伤的Ast，固定后按本室常规方法进行免疫细胞化学及原位杂交分析。

　　二、结果

　　纯化培养的Ast呈大致均一的单层扁平、多角形细胞，具有短而粗大的细胞突起，GFAP免疫细胞化学染色阳性。

　　RT-PCR分析结果表明，Ast损伤后1 d,GFAP mRNA表达水平即明显升高，5～7 d后升高最明显，而正常Ast GFAP mRNA表达无显著变化；原位杂交结果表明，Ast损伤1 d后，GFAP mRNA的表达即明显增高，杂交阳性物质主要分布在胞浆内，3～4 d后，GFAP mRNA表达进一步增高，在细胞突起中也可见到阳性物质；免疫细胞化学染色提示，Ast划伤24 h后，细胞体积增大，突起粗大，GFAP免疫细胞化学染色增强，3～5 d后细胞突起彼此交织，形成网状聚集，GFAP免疫细胞化学染色明显增强；图像分析结果表明，损伤Ast的细胞面积、平均突起长度、数量与正常Ast比较，差异有显著性(P＜0.05)。

　　三、讨论

　　我们通过对培养的Ast在盖玻片上多点划伤，成功复制了体外Ast反应性胶质化模型。损伤的Ast表现出典型的反应性胶质化特征，即损伤的Ast胞体肥大、突起增粗、延长，RT-PCR、原位杂交及免疫细胞化学染色等均证实GFAP的表达上调。我们认为Ast纯化培养比较容易，可以形成能传代的二倍体细胞系；Ast在培养基中生长稳定，不易自发转化，保持了在体情况下的生理功能和对外界因素刺激的良好反应性；纯化培养的Ast既无神经元存在，又消除了在体情况下各种因素对Ast的影响，Ast对损伤的反应基本反映了其自身的性质和机能状况。而且，对Ast施加的各种干扰因素也很容易控制。