不同浓度染铅大鼠海马神经元Ca2+浓度与LTP关系的研究

　　 摘　要　目的：探讨铅对大鼠海马神经元Ca2+浓度的影响及其与长时程增强(LTP)的关系。方法：断乳后Wistar大鼠自由饮用不同浓度醋酸铅溶液(0.015%,0.10%,0.15%)，建立慢性染铅动物模型。高频刺激(HFS)海马区诱发长时程变化后,分离海马神经元,测定［Ca2+］i。结果：各染铅组大鼠海马神经元［Ca2+］i与对照组比较均明显增高（P＜0.05）；血铅浓度(3.28±0.88) μmol/L以上时海马LTP产生率下降，三染铅组PS幅值均降低， lTP阴性组［Ca2+］i明显高于LTP阳性组（P＜0.05）。结论：慢性染铅可使HFS后大鼠海马神经元［Ca2+］i升高，损害海马区LTP的在体诱导；铅致LTP发生率下降与海马神经元［Ca2+］i增高有关。

　　关键词：铅　长时程增强　钙离子浓度

　　海马长时程增强（long-term potentiation ,LTP）是高频刺激（high-frequency stimulation, HFS）传入纤维引起的海马突触传递效能的长时间持续性增强，是在突触水平研究学习和记忆功能的模型。文献表明［1］，铅暴露可损害大鼠LTP的诱导和维持，其机制尚未完全阐明，其中Ca2+在LTP诱导的突触机制中起十分重要的作用。本实验观察了不同浓度慢性铅暴露大鼠海马神经元［Ca2+］i与LTP损害的关系，为探讨铅损害LTP的机制打下基础。

　　1　材料与方法

　　1．1　动物及处理　断乳后雄性Wistar大鼠48只，体重60～100 g,中国医科大学实验动物部提供。随机分为4组，取3组分别饮用0.015%、0.10%、0.15%醋酸铅水溶液，对照组饮蒸馏水，3个月后用于各项指标检测。

　　1．2　HFS诱发长时程变化　将双极刺激电极插入内嗅皮层，记录电极插入海马齿状回，先记录单一刺激（7.5 v，0.1 ms，1次/min，30次）引发的群体锋电位（PS），将每次所测幅值平均为基线值（100%），施加HFS（100 hZ） 5 s后给予单一检验刺激，观察、记录PS变化并与基线值比较。

　　1．3　血铅浓度测定　原子吸收石墨炉法

　　1．4　海马神经元分离及［Ca2+］i测定见文献［2］。

　　2　结果

　　2．1　不同浓度铅对大鼠海马神经元［Ca2+］i及LTP的影响见表1。

　　2.2　染铅2、3组大鼠海马LTP与［Ca2+］i的比较

　　染铅2、3组大鼠血铅浓度虽然相差很大，海马LTP与［Ca2+］i的差异却不显著，将两组按LTP产生与否分组后发现：LTP阳性组［Ca2+］i(140.75±26.98)nmol/L(n=4)，低于LTP阴性组(185.30±29.56)nmol/L(n=10, t=1.98, P＜0.05)。

表1　不同血铅浓度对大鼠海马神经元［Ca2+］i及LTP的影响(X±s)

　　tab.1　Effect of different concentration blood lead on［Ca2+］i and LTP in rat hippocampus (X±s)

分　组	n	血铅浓度 　　(μmol/L)	［Ca2+］i 　　(nmol/L)	LTP产生率 　　(%)	LTP增强率 　　(PS幅值　%)
对照组	8	0.26±0.12	101.98±30.23	87.5	135.88±25.30
染铅1组	7	0.79±0.40	129.14±28.40*	100.0	129.20±25.40
染铅2组	7	3.28±0.88	167.14±38.01**	28.6	124.72±12.96
染铅3组	7	5.49±0.92	178.45±40.58	28.6	117.81±11.31

　　* 与对照组及2、3组相比P＜0.05；**与3组相比P＞0.05

　　3　讨论

　　实验中观察到三组染铅大鼠海马神经元［Ca2+］i比对照组明显升高，说明低浓度铅可干扰［Ca2+］i平衡机制，使海马神经元［Ca2+］i不同程度增高。研究表明，细胞外Pb2+可代替Ca2+激活钙通道， pb2+经钙通道进入细胞，细胞内微量Pb2+即可激活PKC，后者可激活细胞膜、内质网、线粒体的钙通道，使胞外Ca2+内流，内质网、线粒体Ca2+释放，导致［Ca2+］i增高［3］。Dowd等报道［Pb2+］i低于2×10-11M,并证明细胞对Pb2+的吸收是可饱和的，当血铅浓度达一定程度时［Pb2+］i不再继续增高，［Ca2+］i在相关机制的调节下建立起新的平衡。另外，钙通道还存在一个Ca2+依赖性失活机制，即通过细胞内Ca2+水平反馈调节钙通道活性，防止因过多Ca2+流入使细胞内Ca2+超载，铅对这种反馈机制的影响也会导致［Ca2+］i增高，这一作用为铅中毒引起的［Ca2+］i增高提供了更好的解释。

　　从表1可见，染铅1组LTP发生率未受影响，染铅2、3组LTP发生率明显下降，三组PS幅值都随血铅浓度的升高呈现不同程度下降，说明在体慢性染铅可使神经元兴奋性降低，表现为不同程度降低PS幅值，使LTP不能引出，在高铅组甚至还可观察到长时程抑制(LTD)。目前认为，LTP具有N-甲基D-天冬氨酸(NMDA)受体依赖性，位于突触后膜的NMDA受体通道在一定条件下开放，使胞外Ca2+内流，激活细胞内一系列生化反应，是LTP产生的前提条件。Pb2+可抑制海马神经元已激活的NMDA受体，使受体通道开放次数减少，并使之恢复减慢［4］；另一方面, pb2+与Ca2+竞争电压依赖性钙通道上Ca2+结合位点，阻断Ca2+内流，这些作用的结果使细胞去极化时Ca2+内流减少，Ca2+介导的突触递质诱发性释放减少，从而不能充分激活下游反应，使LTP不能产生或难以维持。

　　将染铅2、3组按LTP产生与否分组后发现：LTP阴性组［Ca2+］i明显高于LTP阳性组，说明［Ca2+］i的增高可能是导致LTP异常的重要分子基础。［Ca2+］i增高一方面可直接促进神经末梢内的突触小泡与前膜结合,引起递质释放，另一方面还可增加CaM及CaM依赖性蛋白激酶系统活性，反馈信息传递到突触前膜，也会引起递质释放，两种作用的结果都使前膜自发性神经递质释放增多，导致后膜敏感性降低，进一步影响LTP。

　　总之，在本实验条件下，慢性染铅可使HFS后大鼠海马神经元［Ca2+］i升高， pS幅值下降；血铅浓度达(3.28±0.88) μmol/L以上时可严重损害海马区LTP的在体诱导，这种损害作用与海马神经元［Ca2+］i增高有关。

　　国家自然科学基金资助项目,39470620刘素媛（中国医科大学基础医学院生化教研室,沈阳 110001)

　　孙黎光（中国医科大学基础医学院生化教研室, 沈阳 110001)

　　邢伟（中国医科大学基础医学院生化教研室, 沈阳 110001)

　　刘倩（中国医科大学基础医学院生化教研室, 沈阳 110001)

　　张宪（本钢职工总医院检验科）

　　参考文献

　　1，时利德，蔡葵，滕国玺，等.慢性铅暴露对在体诱导年轻大鼠海马齿状回LTP的损害作用.中国应用生理学杂志，1998,14(1):82～85

　　2，Dildy J，Leslie S. Ethanal inhibits NMDA-induced increases in free intracellular Ca2+ in dissociated brain cell. Brain Res，1989,499(1):383—387

　　3，Pounds J G. Effect of lead intoxication on calcium homeostasis and calcium mediated cell function. Neurotoxicology， 1984,5(3):295—331

　　4，Busselberg D，Evans ML，Rahmann H， et al. Lead and Zinc block a voltage-activated calcium channel of aplysia neurons. J Neurophysiol，1991,65(4):786—795