沙眼衣原体诊断研究进展

　　 摘要 沙眼衣原体感染在人群中很普遍，但临床上并未引起重视，本文综述了近年来诊断沙眼衣原体感染的进展，着重介绍了分子生物学技术在检测沙眼衣原体中的应用，并提出了诊断沙眼衣原体的新的扩大的金标准。

　　沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis,CT）感染是发展中国家可预防的致盲的最重要的原因，也是西方工业化国家最常见的性病。CT可引起泌尿生殖道感染，胎儿感染CT可致新生儿结膜炎、新生儿和小婴儿肺炎，以及其他并发症如获得性反应性关节炎、Retier's综合征[1]。由于CT感染临床表现无特异性，所以常易漏诊。近年来在确诊CT感染方面进展迅速，本文将其综述如下。

　　CT的形态学检查

　　最初诊断CT感染的实验是吉姆萨（Giemsa）染色。这种方法在CT被分离出来前50年就开始应用，通过证实被感染细胞内CT包涵体的存在而判断是否感染CT。但是由于其敏感性和标本收集上有困难，未能成为一种常规检测方法。此种涂片染色的标本要求必须有大量的（数以千计）上皮细胞，而镜检也较费时，同时也受观测者的主观影响。在诊断男性尿路感染时敏感性较低，其阳性率仅为培养证实CT感染的15%。但是在诊断新生儿CT结膜炎时，Giemsa染色镜检被认为是简便、易行而敏感的一种方法，50%-90%的涂片可见胞浆内包涵体及大量多形核白细胞。也可将刮片标本用甲醇固定，碘染色后镜检，因CT包涵体含糖原，遇碘呈棕褐色，即阳性。

　　CT的细胞培养

　　1956年我国汤非凡教授首次在世界上用鸡胚卵黄囊培养CT获得成功。10年后，组织细胞培养CT成功。从病人组织中分离CT，长期以来都被作为一种确诊试验，但是非百分之百敏感，培养失败常由于标本多变或标本收集方法不当而引起。

　　培养细胞现多常用McCoy细胞或Hela-229细胞株[2]，BHK-21细胞也对CT易感。最初操作时使用X线照射过的McCoy细胞，现常用放线菌酮处理过的单细胞层。细胞培养过程中，起决定作用的一步是将接种物离心进入培养的单细胞层内，然后所有细胞在35℃孵育48-72小时，进行Giemsa染色、碘染色或单克隆荧光抗体染色，在光学显微镜下寻找CT包涵体。虽然此方法特异性高达100%。因受标本采集、保存、转运和培养等许多因素影响，多数研究显示敏感性仅为52%-92%[3.4]。

　　CT的抗原检测

　　一、酶免疫测定（EIA） 此方法是将酶与单克隆抗体用交联剂结合起来，形成酶标抗体，检测标本中有无CT抗原。如有CT抗原，则与酶标抗体发生特异性反应，加入酶的底物，底物被酶催化生成可溶性或不溶性呈色产物，即为阳性。可用肉眼或分光光度计定性或定量，其敏感性为93%-98%，10分钟可出报告。

　　二、直接荧光抗体试验（DFA） 此方法是利用荧光标记的单克隆抗体检测标本中有无CT抗原。其诊断新生儿CT结膜炎的敏感性高达95%-100%，20分钟可出报告，但需用荧光显微镜观察。Thomas等[5]用不同方法测定宫颈拭子标本中的CT，EIA可检出稀释至10-5～10-6的原体（elementary body,EB）；而DFA对稀释至10-8后的EB仍可阳性，敏感性较EIA为高。

　　核酸扩增技术

　　近年来，随着分子生物学的发展，核酸扩增技术在常规感染的诊断中很快建立。这些技术主要有扩增探针（Ampliprobe）、聚合酶链反应（PCR）、连接酶链反应（LCR）、核酸自身连续序列复制技术（NASBA）和Q-B复制酶试验。

　　一、扩增探针法　由于非培养检测方法不断发展，DNA杂交也逐渐被应用于诊断CT感染。通常这些实验特异性较高，但并非最敏感。由于需要放射性元素标记的探针而限制了其应用随着分子生物学发展、硫标记的DNA探针及生物素标记的DNA探针解决了这些问题。近年来采用DNA探针直接检测CT tRNA及增强化学发光探针实验（PACE）提高了检测的敏感性。扩增探针系统依赖于检测标志的扩增，而不是模板DNA本身被扩增。与预期模板互补的DNA克隆进入M13噬菌体载体，分离单链DNA在固相支持物上针对模板DNA进行杂交，与M13噬菌体基因互补的第二个探针包裹载体序列，通过碱性磷酸酶而被检测。Thomas等[5]认为PACE dNA探针可检出10-5CT，不如PCR敏感（PCR可检出10-8CT）。扩增探针法检测尿液标本CT，其敏感性和特异性分别达到92%和99%[6，7]。

　　二、PCR PCR检测CT快速，简便，有高度敏感性和特异性。通过特异引物和Taq dNA聚合酶，在一定条件下将标本CT靶片段扩增，然后将扩增产物行电泳检测，据凝胶上预计分子量DNA扩增带的出现判断结果。整个过程需4～5小时。1987年，Mullis和Faloona最早应用DNA聚合经过高温变性，降温退火，适温延伸三个步骤，反复循环30～40次，可将标本中的DNA量扩增109～1012。Φstergaard等[8]经过40个循环，可检测10-17g的CT dNA，相当于1个拷贝的质粒，检测敏感性和特异性分别达到100%～93%。

　　三、LCR法　1991年，Barany从生栖热菌（Thermus aquaticus）中提取耐热DNA连接酶并用该酶扩增DNA获得成功，正式命名为LCR。LCR反应需要两对互补的寡核苷酸探针，在模板DNA、DNA连接酶、DNA聚合酶存在的前提下，通过变性、复性连接的多次循环使靶DNA大量扩增。LCR大大地改善了扩增反应的特异性和敏感性,Stary等[9]认为LCR对各种类型的CT标本都有很高的敏感性。文献报道用LCR检测尿标本中CT的敏感性在95%以上，特异性有99%以上[10，11]，优于PCR及EIA。Nikkari等[12]甚至报道在由CT引起的关节炎滑液的细胞中，LCR也检出CT dNA，而PCR不能。标本中抑制物可影响LCR的结果，而将标本冻融、稀释可减少抑制物，提高LCR的敏感性[13]。

　　四、NASBA法是一个简单、快速扩增核酸的方法，约2小时可将RNA扩增1010倍，它是一个持续的恒温过程，不需要特殊的仪器。类似PCR之处是利用2个引物呈指数地扩增位于引物旁的序列，不同之处在于它需要三种酶：T7RNA聚合酶、核糖核酸酶、鸟类成髓细胞性白血病病毒逆转录酶，且反应处于一个恒定的温度。这三个酶产生逆转录和转录过程，导致靶序列自身复制[14]。NASBA依靠一个逆转录和转录反应持续反复循环，由互补DNA中介复制RNA模板，寡核苷酸链引导DNA合成，并为T7RNA聚合酶编码启动子序列。反应中首先合成双链cDNA，该cDNA作为T7RNA聚合酶的转录模板。而完成cDNA合成有赖于核糖核酸酶消化分解作为中介物的RNA-DNA杂交物中的RNA。足够转录的cDNA产生原始模板的反义RNA，转录产物转化成为含有双链启动分子的cDNA。这些cDNA能产生有义RNA和反义RNA，二者都能重新进入循环。NASBA扩增的效率仅轻微受初始RNA浓度影响，扩增产物的积累量与时间呈指数相关，反应在恒温37℃下进行，迅速，1～2小时孵育后，反应产物可扩增107倍。扩增产物达到105倍仅需15分钟而PCR需85分钟[15]。Morre等[16]认为NASBA在检测尿标本CT感染和宫颈标本有同样的敏感性，且对16S rNA最敏感，只需10-5包涵体形成单位（IFU）即可检出，比PCR敏感10倍。

　　五、Q-β复制酶试验 Q-β复制酶催化一条被称为MDV-1的218个碱基的RNA模板自身复制，12分钟内复制酶可扩增MDV-1模板106拷贝，该实验的基础是三明治杂交、可逆性靶捕获和Q-β复制酶扩增。反应在恒温下进行，4小时内完成。检测CT核糖体RNA和核糖体DNA。使用2种类型的探针：一是特异性捕获探针，另一是可复制的DNA检测分子[17]。由于该技术基于RNA的扩增，而微生物体内含有大量RNA拷贝，故能达很高的敏感性，可用于检测活动性感染，且Q-β复制酶试验受标本中抑制物的影响比较小[18]。An等[19]认为Q-β复制酶可检测5个CT eB，且不受标本中抑制物的影响。

　　自从细胞培育CT成功以来，就一直作为诊断CT感染的金标准，但即使是在有经验的实验室，细胞培养敏感性仍然只有75%～90%。这降低了它在检测低流行人群中CT感染的使用价值。近年来核酸扩增方法在感染性疾病诊断中的广泛应用，LCR具有高度敏感性和特异性，在CT的诊断方法中的地位日趋重要，故Lee[20]提出了诊断CT感染的扩大的金标准，即（1）细胞培养阳性；（2）细胞培养阴性，但LCR阳性且DFA证实。而其他核酸扩增技术，尚需进一步研究，但是非培养方法是今后CT诊断发展的趋势。

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