人源化抗人纤维蛋白单链抗体-链亲和素融合蛋白的表达和功能

　　【 摘要 】　目的　探索人源化抗人纤维蛋白单链抗体-链亲和素融合蛋白的表达和功能。方法　构建人源化抗人纤维蛋白单链抗体（ScFv-8E5）基因与链亲和素基因的重组表达载体，制备融合蛋白，ELISA观察其稳定性、与人及不同动物纤维蛋白的反应。结果　人源化融合蛋白可特异性识别人、大鼠、豚鼠纤维蛋白，同时有生物素的结合位点，且稳定性好，可耐受至少两周4℃保存，数次反复冻融或一定时间的37℃孵育。结论　此人源化融合蛋白适用于大鼠及豚鼠血栓病模型，是作临床前研究的有用材料。

Expression and function of humanized anti-human fibrin single chain antibody-core-streptavidin fusion protein

LI Wenping, XU Jing, SUI Jianhua, et al.

　　(National Laboratory of Experimental Hematology, Institute of Hematology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Tianjin 300020, P. R. China)

　　【 Abstract 】　Objective　To express and characterize humanized anti-human fibrin single chain antibody-core-streptavidin fusion protein.Methods　The humanized anti-human fibrin single-chain antibody-core-streptavidin fusion protein was constructed by inserting a sequence encoding core-streptavidin at the 3′ end of the humanized ScFv-8E5 structural gene. ELISA was used in analysis of its antigen binding ability.Results　The fusion protein was stable, capable of binding to human, rat and guinea pig fibrin, but not to their fibrinogen and bovine albumin.Conclusion　Humanized anti-fibrin singe-chain antibody-core-streptavidin fusion protein could be useful in future study on thrombus imaging and also thrombolytic agents targeting.

　　【 Subject words 】　Anti-fibrin; Humanization; Fusion protein; Streptavidin

　　血栓形成与危害人类健康的许多严重疾病密切相关,发病率及死亡率均较高。抗人纤维蛋白单链抗体与放射性核素或溶栓效应分子结合〔1〕可用于血栓性疾病的定位诊断和导向溶栓治疗，有很好的应用前景。Rosebrough等〔2〕用抗人纤维蛋白单抗与链亲和素交联，产生的融合蛋白用放射性核素标记的生物素作两步法血栓显影获得良好的效果，与传统显影方法相比具有显影本底低、特异性强的优点。本文作者制备了人源化抗人纤维蛋白单链抗体（huScFv-8E5）与核心链亲和素(Core-streptavidin)融合蛋白，对其稳定性、与人及不同动物纤维蛋白结合实验进行了研究，以寻找适合此融合蛋白体内血栓显影的动物模型，目的在于获得结构稳定、特异性强的血栓显影剂。

　　材料与方法

　　表达载体的构建：我室克隆表达的抗人纤维蛋白单链抗体(ScFv-8E5)具有特异性结合人纤维蛋白的活性〔3〕。对ScFv-8E5的VH〔4〕、VL进行了人源化改造，获得的人源化huScFv-8E5与鼠源ScFv-8E5的抗原结合活性无明显差别〔5〕。构建huScFv-8E5基因与链亲和素基因的重组表达载体pSTE2-huScFv-8E5（图1），带有Lac启动子和果胶酶先导序列，在IPTG的诱导下表达，其3′末端的6个组氨酸用于表达产物的纯化。

　　人源化抗人纤维蛋白单链抗体-链亲和素融合蛋白（huScFv::core-streptavidin）的表达和纯化：选取经酶切鉴定正确的阳性克隆用LBGA(含有50μg/ml氨苄青霉素、100mmol/L葡萄糖的LB)培养过夜，次日1∶40倒入新鲜LBGA，37℃振荡培养至A600=0.7～0.9，加入终浓度100μmol/L IPTG室温诱导，表达3 h后收集菌体，超声破碎细胞收集包涵体，用含3mol/L尿素、50mmol/L Tris-HCl、pH7.0的溶液洗涤后加入6mol/L盐酸胍、0.1mol/L Tris-HCl、pH7.0溶液溶解，经固相金属离子亲和层析(IMAC)一步纯化〔5〕。用TEA 缓冲液（0.4mol/L L-精氨酸-HCl，0.1mol/L Tris-HCl，2mmol/L EDTA，pH7.0）透析复性后，Amicon YM 10 membranes浓缩。

　　SDS-PAGE：100μmol/L IPTG诱导组菌体总蛋白及纯化蛋白用10%聚丙烯酰胺还原电泳，考马斯亮蓝染色后观察。

　　huScFv::core-streptavidin融合蛋白与纤维蛋白的特异性结合：用改进的酶联免疫吸附实验(ELISA)〔3〕观察IMAC柱纯化的huScFv::core-streptavidin与各种纤维蛋白的结合。用各种纤维蛋白原(40μg/ml)分别包被96孔板，37℃烤干，用含20%牛血清的DMEM培养基活化纤维蛋白原成纤维蛋白，2% milk/PBS封闭后加入不同稀释度的样品，用PBS代替样品作阴性对照。加入1∶150生物素标记的辣根过氧化物酶(Biotin-HRP)检测结合的融合蛋白，四甲基联苯胺(TMB)为底物。用0.4mol/L的硫酸终止反应后，酶标仪检测450nm处的光吸收度。

　　纤维蛋白原对huScFv::core-streptavidin抗原结合活性的竞争性抑制：纤维蛋白原包被、活化、封闭后，每孔加入50μg/ml抗凝血酶Ⅲ(anti-thrombinⅢ，ATⅢ) 100μl，37℃，15 min。倾去ATⅢ，加入不同稀释度的融合蛋白（预先与终浓度200μg/ml的纤维蛋白原37℃孵育30 min），用PBS代替样品作阴性对照。Biotin-HRP检测结合的融合蛋白，TMB为底物。硫酸终止反应后，酶标仪检测450nm处的光吸收度。

　　结果

　　1.huScFv::core-streptavidin的表达、纯化：100μmol/L IPTG诱导表达的产物经SDS-PAGE表明，huScFv::core-streptavidin融合蛋白单体相对分子质量(Mr)约43×103左右，