HBV转录后调节元件结合蛋白克隆筛选和分析

　　转录后调节是基因表达调控的重要环节之一。乙型肝炎病毒表面抗原S基因下游3′端含有一个转录后调节元件(Posttranscriptional Regulatory Element, PRE)。该PRE在S基因转录产物从细胞核向细胞浆转运的过程中起着重要的作用。已经清楚有两个细胞核蛋白与PRE结合，相对分子质量(Mr)分别为45×103和30×103，统称为PRE相互作用蛋白(PRE-interacting protein, PIP)。其中一个已鉴定为甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，但另1个蛋白的性质未明。本研究应用RNA蛋白印迹试验(Northern blot-Western blot)筛选与HBV PRE RNA特异性结合的表达克隆，用RNA印迹试验(Northern blot)检测该表达克隆在健康人不同组织器官的表达水平。结果从约25万个克隆中筛选出一个与PRE RNA特异性结合的阳性克隆；cDNA序列测定后经与GeneBank比较发现与人的核因子NF90基因有高度同源性，但其中一段为反向同源；氨基酸分析发现该PIP包含了一个与NF90相同的RNA结合区，提示PIP为1个新的RNA结合蛋白。RNA印迹试验显示有2条大小分别为约4.4kb和3.5kb的mRNA与这个cDNA克隆杂交，4.4kb的杂交带以心脏、骨骼肌，肾脏、肝脏的mRNA含量较多。

　　本实验所分离到的PIP克隆不是1个完整的基因，因此尚无法确定PIP基因的大小。从Northern blot的结果来看，与PIP探针杂交的带仅有2条，1条为3.5kb，另1条为4.4kb，结合GeneBank比较分析的结果，已经知道NF90 cDNA的大小为3.5kb，因此推测4.5kb的杂交带可能与PIP有关。在本次筛选中我们仅获得了1个阳性克隆，提示PIP在细胞中的表达量很低，这一情况被Northern blot所证实。Northern blot的结果显示，PIP探针所得到的杂交带，无论是4.4kb，还是3.5kb的杂交带，均显示较弱的信号，证明了与PIP相关的基因在细胞中的表达是低的。目前我们已经在大肠杆菌中表达所克隆到的基因，并进一步分析了大肠杆菌表达的PIP与HBV PRE RNA结合的特异性。分析这一因子功能区以及在HBV S基因转录产物从细胞核向细胞浆转移过程中的作用的工作正在进行中。