痰细菌培养的临床应用

　　摘要：世界范围内抗生素的使用比较混乱，细菌的耐药日趋严重，合理针对性的使用抗生素成为必然，因此必须了解细菌类型和其药敏情况。痰细菌检查的诊断价值是人们一直关注的问题，为了快速而准确的获取痰的细菌情况，国内外学者进行了不断的探索，本文就此进行综述，以利于获取合格的痰标本和快速而准确的细菌学证据。

  　  自从1940年发现青霉素以来，人类就在不断地开发新的药物以治疗细菌感染。尤其近20余年来，头孢菌素和新的氟喹诺酮类及大环内酯药物的出现，为临床医师应用抗生素提供了许多选择，大大地提高了感染患者的治愈率，同时也选择出了许多的耐药菌株。正是因为抗生素的多样化和临床选择抗生素的随机性，人们对于抗生素存在着滥用的情况，尤其在急诊科，存在流水作业，不同的医生对同一个病人会选择不同的抗生素，这同时也选择了细菌，导致了细菌的耐药率的逐年上升。在欧洲，80%以上的下呼吸道感染应用抗生素治疗，大多数医生对急性支气管炎、慢性支气管炎急性发作、社区获得性肺炎、和病毒性呼吸道感染不加以鉴别就应用抗生素，不同的国家抗生素的选择不一样。据美国1994-1995年30个医疗中心的统计显示：约24%的肺炎链球菌对青霉素不敏感，14%为中度耐药，10%为高度耐药。非典型流感嗜血杆菌的耐药已高达36.4%，而在80年代仅为15%。有一374例下呼吸道感染的患者的前瞻性研究表明：耐药肺炎链球菌感染同先前应用β—内酰胺类抗生素有关。因此合理使用抗生素成为防止细菌耐药的一大重要策略。要合理的使用抗生素，除了加强规范化的经验性治疗外，最重要的是明确感染患者的病原菌及其药敏情况，以便针对性的使用抗生素。因此快速而准确的细菌培养是急需解决的问题。
　   下呼吸道感染是指声门以下的呼吸道的感染。包括社会获得性和医院内获得性，在临床上极为常见，其病原菌种类繁多，院内感染者多以革兰氏阴性杆菌多见，混合感染也较多。临床表现也多种多样，通过胸片和症状体征难以鉴别感染的细菌类型，因此病原学检查非常重要。准确获取病原学证据有利于及早明确诊断，根据药敏及时地进行抗菌治疗。获取病原菌的方法多种多样，如血培养，痰涂片和痰培养及经气管吸引术采痰、纤支镜保护性毛刷及肺泡灌洗和肺活检等。血培养阳性率低，其临床应用价值有限，而经气管吸引术采痰、纤支镜保护性毛刷及肺泡灌洗和肺活检均为有创检查，一般患者难以接受，限制了其在临床中的广泛使用。而痰为下呼吸道的分泌物，其病原菌的情况最能真实的反应下呼吸道的感染情况，因此痰涂片镜检和痰培养一直受到临床上的关注，且常规用以指导临床治疗。对此国内外学者为快速而准确的获取病原学证据作了大量的工作，本文就此进行综述，以利于获取合格的痰标本和快速而准确的细菌学证据。

　　一、痰细菌培养存在的问题
　    细菌培养的过程包括临床痰标本的流取和试验室的接种培养及鉴定，二者均直接影响细菌培养的结果，必需同时加以改进，才能提高培养的准确性。几十年来，对于痰标本的临床价值一直存在着争议，其原因主要有：（1）、大多数的下呼吸道感染患者有咳嗽咳痰的症状，但咳痰量因人而异，临床上约有10-30%的患者干咳无痰或咳痰无力，通过自主咳嗽无法获取痰标本；（2）、人体口咽部寄居有大量的正常菌群，尤其是长期住院患者，口腔中的革兰氏阴性杆菌的数量明显增多，咳出的痰液在口腔中停留易被污染，从而影响检查结果；（3）、约15-30%的患者在痰标本留取前已经使用过多种抗生素，一些比较脆弱的细菌如肺炎链球菌和流感嗜血杆菌在应用抗生素后，取任何呼吸道的标本的检出率为0，实际上检出的细菌很大程度上是对所应用的抗生素耐药的细菌，从而使药敏结果对临床用药的指导意义大大降低；（4）、目前绝大多数的医院采用的培养基为2种，即血平板和伊红—美兰平板，使得许多导致呼吸道感染的病原菌不能被分离出来。流感嗜血杆菌是慢性阻塞性肺疾病急性发作期第1位常见的致病菌，其培养需要巧克力培养基和CO2培养箱，但一般试验室都不进行该培养基的培养，从而使得许多常规培养为阴性，这样痰培养对指导临床用药的帮助大大降低。（5）、对于常规痰培养而言，试验室多采用白金耳环取痰中极少一部分在培养基中划线培养由于痰中细菌的数量和种类的分布不均匀，接种时可能所取的部位没有致病菌或只接种了一部分致病菌，这使培养的阳性率大大降低。尽管如此，痰液毕竟是下呼吸道的分泌物，其病原菌情况最能真实地反应感染的细菌，因此提高痰培养的准确性是临床医生和细菌学工作者极其关注的问题，并对此作了许多改进，从而更有效地指导临床用药。

　二、痰细菌培养的改进措施
　    痰诱导的方法现已成功地应用于研究哮喘的气道炎症，其诱导成功率约为76-100%，这是一种简单、安全的获取下呼吸道痰液的方法。近年来有人建议应用此方法对干咳无痰的患者进行诱导，然后进行痰培养，这使得痰培养的应用范围扩大了，但有的患者基础肺功能差，根本不能耐受诱导或诱导后患者病情加重，在一定程度上限制了其应用。为了消除口腔寄生菌的污染，有人应用0.1%的洗必泰或0.1%的新洁尔灭或H2O2漱口然后留痰，结果能明显减低污染率。同时对咳出的痰液用0.9%的盐水洗痰3-4次，然后应用痰液消化液如1.8%的NH4CL或N-乙酰半胱氨酸钠进行消化，使痰液均匀化，接种的阳性率大大的提高。口腔寄生或唾液中含有的杂菌浓度可高达106-9/ml，Bartlett将冲洗后的痰做细菌定量培养，可降低标本的污染平均浓度为103-4/ml，其阳性菌株与经气管所获标本结果一致。Dixon报告稀释10000倍的痰培养结果并显著降低致病菌的阳性发现率，但可降低因污染引起的假阳性率（可降低到21%）。作者曾应用显微镜观察漱口前后咳出的痰液和用0.9%的盐水冲洗后的痰液，发现涂片中鳞状上皮细胞明显减少，这样获取的痰标本90%以上能达到合格：鳞状上皮细胞〈10个/低倍视野，白细胞〉25个/低倍视野。因此必需强调漱口和消化痰液的重要性。对于采取的痰液消化剂而言，必须具有消化痰液的能力，同时又不能抑制细菌的生长。许多人采用的1.8%的NH4CL或N-乙酰半胱氨酸钠对大多数细菌无抑制作用，但对比较脆弱的细菌如肺炎链球菌的生长抑制比较明显，这不利于准确地进行痰培养，因此寻找合适的消化液是消化痰液必需解决的问题。培养基的选择也是影响痰培养的很重要的原因，余国华等人设计了“全痰系列分离法”，应用7种培养基对慢性阻塞性肺疾病患者的痰分离菌群和口腔分离菌群相对照，成功的评价了慢性阻塞性肺疾病患者急性加重期的致病菌情况，同时指出：只有痰细菌浓度较唾液同种细菌高100倍以上，方能确认其在支气管内丛生。除了对常规留痰方法进行改进外，国内外学者都在为获得无污染的下呼吸道分泌物而努力。进气管吸引术，可避免口腔正常菌群的污染，主要用于肺部厌氧菌的感染、免疫受损的患者和非典型肺炎的病原菌检查，但其副作用大，患者不易接受，目前已很少应用。侯显明等人通过经气管穿刺吸引痰培养和经口痰菌定量培养的比较，得出定量培养的判断标准：菌群>107cfu/ml可认定为致病菌；菌群〈107cfu/ml，但>104cfu/ml且当两次培养结果相同时，也具有临床意义；如菌群〈104cfu/ml其菌属与对照吸引痰培养不一致时，提示为口腔菌群污染。纤支镜的检查不但可以目视三级以上支气管的内壁情况，同时也可以通过灌洗和保护性毛刷采样而获取下呼吸道分泌物进行培养，定量培养后，菌群>103cfu/ml可有临床意义。目前保护性毛刷采样进行定量培养被认为是痰细菌培养的“金标准”，其敏感性可达80%，特异性达90%。单套管和双套管保护性毛刷采样进行培养其结果无显著性差别。它最适合于没有进行抗生素治疗和停用抗生素48小时以上的患者。但这些为有创检查，一般患者难以接受，其临床的广泛应用受限，但对于复杂肺炎的患者，明确病原菌的类型和药敏情况具有重要作用。
　    对于特殊细菌如结核杆菌的检查是人们比较关注的问题，其培养一般需要4-6周，很不利于指导临床用药，尤其近年来结核杆菌的耐药问题日趋严重，临床急需根据药敏指导用药，因此快速准确地检测结核杆菌及其药敏情况是必须解决的问题。国内外学者对此也进行了大量的研究。应用聚合酶链反应（PCR）的方法快速检测痰中的结核杆菌，Kolk AH等人的研究表明：对于所检测出的35例结核患者临床资料大都支持。对于无痰的患者可采取痰诱导的方法解决，并且对诱导痰进行PCR对于诊断结核非常有用，PCR的结果和痰培养的结果互相补充。但是PCR的影响因素很多，其假阳性很高，目前国内仅限于科研而少应用于临床诊断。

　　三、细菌鉴定的准确性和速度提高
    　细菌的鉴定经历了由手工到自动的过程。传统的分离与鉴定细菌的方法十分麻烦，并且都依赖于细菌的生长，现已有不依赖于细菌生长的鉴定技术和方法。目前已有细菌和药敏的成套的鉴定系统，如手工（Apc）鉴定系统、自动（ATB）鉴定系统和UTTEK—全自动微生物鉴定系统，其鉴定速度快，准确性提高，免除了繁琐的手工操作，以往痰培养结果一般为7天，目前3-4天就可以出来，为及时准确地指导临床用药提供了方便。Vitek—AMS自动鉴定系统是国内全自动系统应用最广泛的一种，全世界也有4246家实验室应用该系统，它既能进行鉴定又能进行药敏实验。美国最普遍使用的MicroScan系列可鉴定近500种细菌，鉴定速度快。ATB Expression半自动细菌鉴定系统可鉴定770种细菌和分析近80种抗生素药敏实验，可进行苛氧细菌、嗜血杆菌、奈瑟菌、厌氧菌、真菌和支原体的药敏。但传统药敏实验的基本方法并无大的改变，如琼脂培养基法包括琼脂稀释法、有限琼脂稀释法和滤纸片扩散法，肉汤培养基法包括用于自动化测定的微量肉汤稀释法和肉汤滤纸片稀释法，均为目前大多实验室采用的药敏方法。
  　  有的细菌如肺炎球菌、流感嗜血杆菌和金黄色葡萄球菌具有典型的形态，在痰涂片时就能识别出来。因此痰涂片也可以及时地明确部分典型细菌，（对于金黄色葡萄球菌希氏内科学（第20版）未列为此类典型细菌）为指导经验性的临床用药提供帮助，正确使用抗生素，但其药敏情况及是否混合其它病原菌感染有待于痰培养后明确，因此二者不可偏废，彼此验证，更正确而迅速地为临床提供帮助。