双歧杆菌粘附素的提纯

　　双歧杆菌存在于人体肠道，对宿主发挥生物屏障、营养、免疫、控制内毒素血症、延缓衰老、抗肿瘤等生理作用，已广泛应用于益生菌制剂(Probiotics)。由于双歧杆菌粘附于肠粘膜上皮细胞是其发挥作用的首要条件，开展对其粘附机制的研究有着重要意义。我们对双歧杆菌的粘附素进行分离纯化。

　　双歧杆菌粘附活性检测采用已建立的Gram染色法。收集双歧杆菌1　027株培养上清2　500ml，加入饱和硫酸铵溶液至终浓度为30%，4℃搅拌3小时，4℃8　000r/min离心30分钟。沉淀物溶解于0.01mol/L pH7.4 PBS中，准备上柱。采用LKB bROMMA 快速蛋白液相色谱系统(FPLC)，用0.02mol/L pH7.0 PBS，平衡Superdex75(Pharmacia)柱(1.6×55cm)后，加入硫酸铵沉淀物1ml,0.02mol/L pH7.0 PBS进行洗脱，洗脱速度为0.7ml/min,226nm波长检测光密度ABS值。收集各组分，检测粘附活性，合并活性组分，冷冻干燥浓缩后，进一步纯化。用0.05mol/L pH8.0 PB 平衡Q-Sepharose FF(Pharmacia)柱(1.2×10cm),加入Superdex 75柱活性组分。先用0.05mol/L pH8.0 PB洗脱，然后分别用含0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L及1.0mol/L氯化钠的0.05mol/L pB进行阶段洗脱，洗脱速度为1.5ml/min,226nm波长检测，收集各峰检测粘附活性，活性峰产品冷冻干燥，纯度采用不连续SDS-PAGE系统进行分析，凝胶用硝酸银染色。结果：30%硫酸铵沉淀物经Superdex75凝胶过滤，活性部分位于第二峰的起始部，初步判断该物质的相对分子质量在14×103与23×103之间。进一步对Superdex75层析得到的活性组分进行Q-Sepharose FF离子交换层析，共得6个洗脱峰，第一峰为对应活性峰，SDS-PAGE分析表明，硫酸铵沉淀物经Superdex75凝胶过滤和Q-Sepharose FF离子交换层析后，得到1个单一条带蛋白质，相对分子质量为16×103。

　　我们首次采用硫酸铵沉淀，凝胶过滤和离子交换色谱法，从双歧杆菌耗尽培养液上清中纯化出一种相对分子质量为16×103的蛋白质，为进一步研究双歧杆菌粘附素提供了初步资料。