固有肠内菌对大肠粘膜特性的活化和修饰

　　包括人类在内，在动物肠道内的每克内容物中，定植着1011～12的肠道细菌，其种类也是极其多样的。如今，虽然将这些复杂的微生物统称为肠道菌群，但是，关于其构成以及对机体的作用，仍有很多不明之处。可是，如同在益生菌等所见到的那样，在世界范围内，正在尝试着积极利用常居性肠道细菌，以期待着阐明肠道菌群的作用。本综述将介绍把特定的肠道细菌种单独或混合定植于由无菌动物来说的悉生动物的试验成果，进而来论述肠道菌群的作用。

　　从比较无菌动物和清洁动物(主要为大鼠)的试验成果来说，肠道菌群的存在，对于宿主动物的生理，尤其对肠道影响很大。这方面虽然受到了启发，但是还有许多基本的疑点。例如：

　　疑点1　使无菌动物肠粘膜的特征普通化所必需的细菌种是什么?

　　如上所述，观测肠内容物、粪便中的100种以上的微生物，虽然形成肠道生态系，但是，肠粘膜的特征向普通动物型变化，是否需要如此之多种多量的肠道细菌?另外，各菌种的有用率是否相同?(根据肠粘膜各自的特征，能够充分地予测到有用的肠道细菌的菌种是不同的，所以，首先有必要特定肠粘膜的特征。)

　　　疑点2　肠道菌群对小肠发挥着怎样的作用机理?

　　迄今，在比较和研究无菌动物和普通化动物过程中，绝大多数认为小肠的特征有着明显的差异。不言而喻，虽然认为对小肠的理解较大肠有所进展，但是，一般来说，小肠的肠道细菌的菌种、菌量都少。对小肠粘膜带来特征变化的肠道细菌，究竟是存在于小肠内的肠道细菌中呢?还是通过栖息在大肠内的大量的肠道细菌，间接地诱导小肠粘膜的变化呢?

　　疑点3　肠道菌群和宿主动物的结合有特异性吗?

　　各种动物构成了各具特征的肠道菌群，用显微镜观察鼠和人类粪便菌群的涂片标本，能很容易地判断其差异。一般认为，两者的差异主要起因于梭菌属是否含有梭形菌型(Fusiform type)。但是，从分类学上，多是以种的标准表示着在肠道菌群不同种动物的构成差异。这种情况究竟是暗示了宿主动物和肠道菌群的密切结合呢?还是反映了食性差异等环境要因呢?肠道菌群的构成及其宿主动物种间是否有着必然的联系?

　　上述疑问，在影响肠道细菌种及其肠道细菌的宿主动物方面，特定其特征，如果能够正确了解其对应关系的话，则都能够很明确地搞清楚。

　　1　分节丝状体细菌的存在及其细菌学方面的性质

　　如在疑问2所提及的那样，与大肠相比，小肠中的肠道细菌非常少。既使在内容物开始滞留的回肠部内，也仅是大肠中的千分之一的程度。但是，我们了解在多数动物种中，结合并栖息在小肠上皮细胞管腔内的肠道细菌种。在显微镜下观察到的用福尔马林固定小鼠回肠绒毛的标本，有竟达到数百微米的分节丝状细菌。这就是分节丝状菌(segmented filamentous bacteria)。如果提高倍数，可以看到裂殖体进入菌体中的现象。如后所述，我们制作并解析了裂殖体细菌单独定植小鼠和大白鼠，明确了该细菌引起宿主方面的的特征、尤其修饰和活化小肠粘膜的特征。于是，首先决定该细菌的16SrRNA的碱基配列，为了划定细菌学上的应有位置，进行了系统分类。迄今，在我们的研究组和Snell的研究组中，决定了小鼠、大白鼠、猴、鸡的4种6系统动物的裂殖体细菌的16SrRNA碱基配列。一般认为裂殖体细菌间的相同性极高，形成一种自然群。虽然认为在已知的细菌种中，分节丝状菌是从梭菌属的某个种中分岔出来的，但是，从碱基置换率来看，其距离相距很远，分节丝状菌以其自身形成一个独立群的想法大概是事实。Tannock等和Koopman等报答了分节丝状菌在小鼠和大白鼠之间也不能互相交叉定植，证实了系统分类的结果。其他普通细菌学性质，因不能在试管内培养，是今后待研究的课题。

　　2　无菌动物和普通化动物

　　为了解肠道细菌的作用，比较无菌动物和普通化动物是最合适的手段。试验成果指出，二者之间，不仅在消化道，而且在全身都存在着明显的差异。本文的焦点放在肠粘膜免疫系统、尤其放在最近被重视的肠上皮细胞淋巴细胞(IEL)上，试图解析肠道菌群的成分。

　　首先，将小鼠自身的粪便菌群强制地定植地无菌小鼠内，追踪肠道菌群形成时IEL的行迹。无菌小鼠的rδTCR阳性细胞(rδIEL)比αβTCR阳性细胞(αβIEL)多3倍，但普通化后，αβIEL和rδIEL的比率发生逆转，清洁化2周以后，αβIEL则处于优势。如果用细胞数进行比较的话，rδIEL的细胞数仅有少量增加，而αβIEL则增加10倍以上。另外，Thy-1阳性IEL也明显增加。大约rδIEL的全部和αβIEL的大部分为CD8阳性，其中，在IEL中有特征性的CD8α的同型二聚体占50%以上。上述结果从给无菌、普通及清洁小鼠注射胸腺嘧啶核甙的类似体——溴脱氧尿核甙(BrdU)，并进行连续标记时，从IEL的各亚群的BrdU标记率的变化中也能够得到证实。以上试验显示了，把握αβIEL和rδIEL两个亚群的动态，在解析肠道菌群的效果方面，能够形成有效的参数。因此，作为解析肠道菌群的第1阶段，将IEL的两个亚群的比率作为指标，来划分肠道菌群分离源的不同影响和肠道菌群。

　　3　修饰、活化小肠粘膜特征的肠道菌群分离源的影响和肠道菌群成分的划分

　　为了评价肠道菌群对机体的作用，如前所述，以IEL特征作为指标，调查了宿主方面的应答。尤其着眼于迄今已知的将无菌鼠的盲肠尺寸缩小到清洁小鼠的大小的厌氧性有芽胞菌，将各种动物的粪便和用氯仿处理的粪便投入到无菌小鼠内。如前所述，将小鼠的IELT细胞的构成比变成清洁小鼠型，仅限于小鼠粪便菌群或用氯仿处理的粪便菌群。人和大白鼠的粪全未见效果。另外，搞清楚了该结果不单单是IEL的构成比，关于IEL的细胞障碍活性和肠上皮细胞的各种特征、盲肠大小也得出同样的结果。因此，虽然是在所限定的种的范围内，但是，使小鼠肠粘膜的特征变成清洁小鼠型，暗示出是需要来源于小鼠的肠道菌群。这种情况可以推测出以前所提倡的原藉菌群的通用结果。将耐氯仿的肠道菌群在试管内用EG琼脂培养基作厌氧培养，无选择地收集100个菌落，将它们投到无菌小鼠，但其划分未发现效果，使肠粘膜特征变成普通型的肠道细菌是耐氯仿的，至少可以推测是用EG培养基不能培养的肠道细菌种。尤其在鼠的肠内容物中，所观察到的菌数和能够培养的菌数的差距是极大的，这种耐氯仿的肠道细菌，不能培养的居多，极难于进一步划分，目前尚未着手。然而，先前所介绍的粘附于小肠上皮细胞的分节丝状菌因耐氯仿(具有形成芽胞的性能)，目前也尚未培养成功，是无菌小鼠普通化所必需的肠道细菌的一个侯补。从迄今的结果来看，任这种分节丝状菌单独定植的悉生动物中，除了盲肠尺寸外，我们所解析的小肠粘膜特征都变成普通化小鼠型，分节丝状菌不是单一侯补，正在成为极为有力的候补。

　　4　用悉生动物解释动物肠道菌群和宿主动物相互作用

　　采用已经单独定植分节丝状菌的小鼠，将其粪便用生理盐水制成悬液，经口投入无菌小鼠(BALB/C)，在无菌隔离室内饲养。其后，逐时杀死，测定肠上皮细胞间淋巴细胞(IEL)的细胞数、表现型、细胞障碍活性、肠内容物的IgA量、以及小肠上皮细胞(IEC)的分裂指数、组织相容性复合体组Ⅱ分子的发现、糖脂质GM1 fucosy1化、吸收细胞/杯状细胞的比率、二糖类分解酶活性。

　　4.1　对肠粘膜免疫系统的效果

　　在裂殖体细菌投入前和投入后，在肠粘膜的机体防御系统中，逐时地调查了发挥重要作用的IEL细胞数、表现型、细胞障碍活性。从投入分节丝状菌之后的第14日起，IEL细胞数明显增加。明确了具有αβT细胞受体的T细胞、有Thy-1抗原的成熟T细胞的比例增加的现象。这些IEL显示出以癌细胞——P815细胞作为标靶的细胞障碍活性。还进一步促进分泌型lgA的产生。

　　4.2　对肠上皮细胞的机体防御因子及其他因子的效果

　　认为是病原细菌受体的GM1糖脂质，通过投入裂殖体细菌，呈现出能引起Fucosyl化。进而，为了提示对T细胞的肠道抗原，必要的级组Ⅱ分子是在投入裂殖体细菌之后的7～14日，在肠上皮细胞上发现的。

　　其他，作为肠上皮细胞分裂指数的促进指标、肠粘膜上皮细胞的成熟指标所用的吸收细胞杯/状细胞的比率也增加，二糖类分解酶活性也因投入分节丝状菌而与普通的SPF小鼠相同。

　　4.3　裂殖体细菌和梭型细菌对大肠特征的影响

　　当观察裂殖体细菌对单独定植小鼠结肠IEL的影响时，尽管分节丝状菌单独定植，IEL的表现型虽然与无菌小鼠不同，却显示出与小肠不同而清洁小鼠型的变化小。这可以认为在大肠内裂殖体细菌定植性不良的起因，尝试着将构成鼠大肠的主要菌种——梭型菌单独定植(实际上是梭型菌厌氧菌的混合)或者与丝状体细菌混合定植。其结果，发现梭型菌定植小鼠，比分节丝状菌单独定植小鼠能向普通化型变化。观察到裂殖体细菌和梭型菌细菌混合定植小鼠，向普通化型变化更强。尤其是这种变化，发现αβIEL中的 cD4和CD8的T细胞的构成比CD8的α同型二聚体和αβ异型二聚体的构成比都是明显的。在盲肠的IEL中，也都显示出同样的倾向。

　　另外，迄今关于采用普通化指标的盲肠重量，未发现裂殖体细菌单独定植使盲肠缩小，与无菌小鼠几乎相同，观察到可培养的梭型菌群(主要的)的定植开始增加，盲肠变小。盲肠缩小的现象，从前述的人菌群小鼠和大白鼠菌群小鼠也能发现的情况以及裂殖体细菌单独定植小鼠的盲肠缩小的很小的情况，可以推测出盲肠大小缩小的机理和迄今所述的小肠各种特征、大肠IEL的变化机理是不同的。

　　分节丝状体菌和梭形菌的混合、定植小鼠的裂殖体细菌粪便中的菌数比单独定植的抑制低，在小肠(回肠)内容物中，梭形菌也定植，大约能确认105个/g分节丝状体菌。

　　4.4　小结

　　通过对无菌小鼠投入裂殖体细菌，显示出对消化道粘膜的机体防御发挥很大作用的IEL的增加和活性化，在小肠上皮细胞中，为了提示对T细胞的肠道内抗原，必要的级组Ⅱ分子被肠上皮细胞所诱导。进而，作为铜绿假单胞菌)(Pseudomonas aeruginosa)的细胞粘附受体而发挥作用的GM1糖脂质也被肠上皮细胞所fucosy1化，显示出病原菌和病毒受体活性被阻滞的可能性。其他，作为小肠上皮细胞分裂指数的促进指标和小肠粘膜上皮细胞的成熟指标而采用的吸收细胞/杯状细菌比率、二糖类分解酶活性都通过投入裂殖体细菌，与普通的SPF小鼠相同。一般认为，这些情况暗示为了功能性地消化吸收而增加潜在的能力。以上的结果都是通过不含病原性细菌的常居性肠道菌群所引起的效果。即明确了在肠道菌群中，裂殖体细菌至少是担当这些生理作用的肠道细菌的一种。

　　裂殖体细菌的效果在小肠中尤其明显，通过分节丝状体细菌，大肠的IEL表现特征虽然接近于普通化，但没有发现用普通化小鼠、耐氯仿细菌群观察的盲肠尺寸的缩小、结肠上皮细胞的分裂指数的增加的情况。用分节丝状体菌和小鼠大肠的主要构成菌种——梭形菌菌群的混合定植小鼠，首先看到盲肠尺寸的缩小的情况，一般认为，当IEL的表现特征更接近清洁型时，对大肠特征的普通化来说，梭形菌的存在是必要的。分节丝状体细菌和梭形菌群混合定植小鼠中，确认了分节丝状体菌在小肠、梭形菌在大肠都有更多的分布。另外，这次所用的梭形菌群以耐氯仿性用EG琼脂培养基在厌氧条件下可增殖，大部分细菌是梭形菌集团的状态，一般认为今后这些菌群进一步纯化是可能的。在评价肠道细菌方面，肠粘膜的各种特征对宿主的生理机能来说，是极为重要的。因此，如上所示，可推测出以分节丝状体细菌为中心的常住性肠道细菌对消化道产生特异作用，并与宿主动物很好的共存着。

　　5　关于肠道菌群在肠粘膜中的作用机理的假谘

　　关于肠道菌群的作用机理，一般理解为肠道细菌产生的代谢产物、通过肠道细菌引起的代谢、被修饰的来自宿主的物质、肠道细菌的细胞壁等菌体成分直接地影响肠粘膜，或者由消化道吸收后影响机体。虽然考虑到裂殖体细菌的场合也相当于任何一种场合，但是，普通的肠内容物的分析与无菌动物的内容物几乎无变化。另外，还观察到分节丝状细菌跟肠上皮细菌有很强的接合像，但尚未见到在机体内易位的报告。当考虑到这种情况时，一般认为分节丝状体细菌的作用机理与前述的机理有可能不同。这时，特别应该注意的是裂殖体细菌在肠内存在的形式。现在，我们就其结合机理进行解析，假定在与肠上皮细胞的某种成分之间，存在受体配体的相互作用。设想分节丝状体细菌的菌体的一部分跟肠上皮细胞受体结合，诱引某种信号传导变异，可能导致向肠上皮细胞、IEL的一系列变化。从Regnault等的报告中，明确了比较无菌小鼠和清洁小鼠的IEL的αβT细胞抗原受体(TCR)，两者使用β链的频率相同，在各克隆大小上存在不同。该结果暗示着与其说IEL不是认识肠道细菌的多样性，不如说肠道细菌的定植促进调节着IEL增殖的应答机理。分节丝状菌单独定植小鼠的β链虽然未解析，却予想到尽管分节丝状菌单独定植，β链的使用频率也是相同的，以上的结果大概是更好地理解尽管单独定植，也能诱导IEL增殖应答的结果吧。

　　根据上述讨论的裂殖体细菌和宿主动物的作用机理，对于最初提出的疑点，虽然得到了部分的解答，但是关于分节丝状菌以外的肠道细菌的作用，仍然还是不清楚。另外，这次介绍的结果，在人等动物种中是否还具有普遍性，仍未解释清楚。虽然观察到一部分乳酸菌对胃、肠粘膜也有强力的结合，但对机体的影响仍为今后的问题。通过裂殖体细菌的作用机理的解析，期待着明确肠道菌群广范效果的一部分。

　　作者单位：大连市医药管理局科技质量处