组合型人工肝的研究进展

　　摘 要 近年来以生物人工肝为主附加血或血浆灌流组成的体外的组合型人工肝辅助装置，成为研究最多的、最有希望的人工肝。本文就此型人工肝的意义，研究近况、存在的问题与前景作了综述。

　　1、导 言

　　 近年来，人工肝的研究有了很大的进展。目前分为四型：（Ⅰ）非生物型；（Ⅱ）中间型；（Ⅲ）生物型；（Ⅳ）组合型[1]。研究最多的是组合型人工肝装置（Hybrid artificial Liver Device ,HALD）,亦称组合型人工

　　肝支持系统（Hybrid Artificial Liver Support System,HALSs），是由Ⅲ型加Ⅰ型或Ⅲ型加Ⅱ型组成。这是因为过去40多年里，人们先后尝试了血液透析、血液透析滤过、血或血浆灌流、血浆置换、活性炭灌注、交叉循环、交换输血及整体洗涤等多种形式的人工肝辅助装置，用这些方法虽然改善病人的神经状况，但不能改善其生率[2]。因此，人们认识到用肝细胞的生物肝才是较理想的人工肝。而生物肝虽然能较好地替代肝脏的解毒与生物合成功能，但急性肝衰竭患者体内积累的大量代谢产物及毒性物质，难以在有限的交换中由肝细胞来解毒，反过来还可能对培养肝细胞的存活及生物学功能产生不利影响，如将生物人工肝与偏重于解毒作用的人工肝结合起来，可使人工肝辅助装置的作用更完善。目前报道最多的是生物人工肝加上血或血浆灌流装置，后者内置活性碳或树脂等吸附剂[3]。

　　2、组合型人工肝的适应证意义

　　就目前所知，肝脏至少有600多种酶。在医学领域里有很少情况比急性肝功能衰竭更具有破坏性，这是因为会细胞的坏死破坏了肝脏的合成，代谢、解毒和排泄功能与途径，导致高达80%的死亡率[1，4]。在未来人工肝有可能成为治疗急性肝功能衰竭的主要手段之一，通过下列途径得以治疗，并包括治疗一些相关的疾病：（1）肝组织再生，如果肝脏以前的结构与功能是正常的，暴发性肝衰幸存者的肝组织可以完全再生，同时人工肝的肝细胞可分泌一些促再生的物质如肝细胞生长因子返回到病人肝脏中，促进肝细胞的再生，因此人工肝有可能维持肝衰病人存活，一直到肝细胞再生与功能恢复。（2）肝移植的桥梁：尽管肝移植术是目前治疗肝功能衰竭的唯一有效办法，但受严重的器官短缺所限制。一个理想的人工肝有可能通过支持肝功能来解决移植前的重在难题，直到有一个合适的供肝被移植。（3）治疗肝移植后的最初无功能（PNF）。（4）提高再移植的存活率：如果人工肝能使肝的急症再移植手术变成择期手术的话，可提高再移植肝的存活率[5]。（5）有助于行肝叶吸量切除术，肝叶极量切除术后用人工肝支持其功能，使病人渡过危险期一直到肝组织再生。（6）人工肝可减少肝癌化疗的毒性作用。（7）有可能治疗和预防慢性肝功能衰竭的失代偿[5]。

　　3、组合型人工肝研究的现况

　　 目前大多数组合型人工肝包括生物成分、生物反应器和血或血浆灌流三个部分[3，6]。

　　3.1 生物成分

　　 为了替代肝脏的功能，曾试用了肝脏的切片、细片、冻干粉沫、肝细胞酶等，但因其机能短且质量低，现很少应用。目前所用的多为动物或人的肝细胞。

　　 3.1.1 细胞来源

　　动物肝细胞中猪肝细胞为首选。虽然分离后的肝细胞在体外很少增生，但来源是无限的。尽管动物试验与临床有可喜的报告。但问题是动物肝细胞所合成的物质能否完全取代人的相应物质，并且异基因蛋白和酶进入到血循环中也能出现副作用[4，7]。用人的肝细胞似乎是理想的，然而体外分化的肝细胞很少增值，因而其来源成了问题。现常用的人肝细胞系是肝细胞瘤或肝胚细胞瘤，它们具有肿瘤的基因特征，虽然能表达一些特殊的酶且能合成一些蛋白和尿素，但这些细胞提供葡萄糖和代谢乳酸以及合成尿素的能力是很低的，同时对这些细胞引起的危险和副作用知甚少[8]。可行的事实是可以改变它们的基因型和表现型以及形成亚克隆，而仍具有分化功能。另一种希望是将来弄清肝细胞增生和分化的机制，在此基础上通过基因工程在体外产生理想的稳定肝细胞系并贮存起来，当需要时用分化因子刺激；这种技术在其它高度分化的细胞中已经应用。用胎儿肝细胞在试管内增生并很可能被刺激而分化，这需要一些关于肝细胞分化的基础研究，也涉及到伦理问题。

　　3.1.2 细胞培养

　　在肝细胞单层培养中，尽管维持了几种重要的代谢功能。但细胞在24小时内失去了连接，在5天内失去特殊功能，于1-2周内死亡。以后由于认识到了肝细胞与肝细胞之间、肝细胞与基质间的相互作用对于肝细胞保持分化功能与活性非常重要，使培养了的肝细胞经长时间的也能保持其功能[2，10]。这是肝细胞培养技术的一个重要突破，因而使动物试验与临床有初步的效果。新改进的技术在培养基质中加有生长因子、激素和细胞外的基质成分以及与肝非实质细胞共同培养。培养技术由最初的单层培养发展到不同的方法如多层平板型、胶原三明治状、球型聚集肝细胞、微囊肝细胞、微载体肝细胞培养、聚乙酰内酯培养等[2，11]。分离后的肝细胞需要固定在载体基质上如微载体、或多孔材料如树脂、或多孔微载体、微型海棉等，其它固定化技术包括将肝细胞置于水凝胶中。目前多用的是将细胞固定后粘附到中空细纤维壁外或腔内培养[6]。

　　3.2 生物反应器

　　 3.2.1 生物反应器的设计要求：

　　一个理想的生物反应器应包括以下基本内容：（1）细胞培养技术：生物反应器不仅能满足细胞量的需求，并且应提供足够的膜面积以供肝细胞固定和培养。（2）膜的特性：应保护植入的肝细胞不被宿主排斥，阻止病人血中的抗体和免疫成分进入。现已证实膜截留物质的分子量在5-10万间能有效地阻止免疫成份。期待一种多孔的，海棉状的和相当亲水性的膜，以使细胞更易粘附和发挥更大的功能。（3）生物物应器的生物相容性：如同血液透析器一样，膜的选择和内装的物质不应引起病人的生化和免疫反应。（4）膜的弥散：生物反应器应保证成功地去除血中的毒素并使肝的特殊因子返回到病人的血中[12]。

　　3.2.2 生物反应器的类型

　　目前应用最多的生物反应器仍为中空纤维，所用半透膜多是醋酸盐纤维素膜和纤维蛋白修饰的多聚砜膜。根据培养形式分为两大类：一类是细胞培养在中空纤维或毛细管内腔，另一类是细胞培养在膜外腔。临床治疗效果至少取决于三种因素，即细胞培养技术膜的特性和生物反应器的构型。

　　常见的生物反应器构型包括：（1）细胞培养在中空纤维腔内凝胶床中：Nyberg等于1992年提出将原代肝细胞和胶原凝胶混合后植入中空纤维管内，当凝胶收缩时在腔内形成一通道，利用此管道来增加细胞的营养，血液或血浆通过膜外循环，并产生第二个层流以减少血膜的界面与浓缩界面之间的阻力，也减少血凝块的形成；缺点是流动液体中的浓度级差可使凝胶深部的细胞营养不足和代谢产物累积。（2）细胞培养在中空纤维膜外：1972年Gullino等报告了分离的哺乳细胞能够成功地培养在中空纤维壁外，这些管排列在一个壳内，即壳一管构形，血液于管腔内循环灌注，血液中的毒性物质可通过半透膜而代谢，肝细胞分泌的营养成分进入血中。优点是细胞容易且很快地种植，细胞的植入量不受管内径的限制，因此细胞群和微载体附的肝细胞已培养在这型的生物反应器上，并且已商业化[12]。（3）细胞在毛细管膜编织的网间培养：这一生物反应器的概念于1993年由Gerlch等提出，其主要组成是用毛细管编织成垫，形成三个平面，每个平面呈90度角形成三维结构，三个平面分别运输氧、营养物质和血浆，肝细胞培养在管膜外，且可与细胞外基质或其它哺乳细胞共同培养[13]。已有报道，此种反应器的细胞密度可高达2.5×109/ml，细胞的功能达到5周之久[14]。优点是运输的氧将供给血浆，同时随着浓度差也可营养肝细胞。同样，营养物质亦能供给血浆中相当数量的细胞而不依赖于溶质的浓度。不同的膜垫组合，甚至在同一组中不同的膜垫，在不同的压力下可以促使通过细胞弥散对流来运输高分子量的溶质和迅速补给所消耗的溶质。溶质也随着单纯的弥散使其弥散能力极大地增强。然而这一现代化的装置至今没有得到临床应用，并且关于动物试验的效果知之甚少[12]。

　　3.3 血或血浆灌流

　　为了辅助生物肝的解毒功能，目前临床上试用的组合型人工肝多是用血浆分离后通过活性炭或树脂来吸附毒性物质再灌注到中空纤维中。血浆通过灌流去除中、大分子物质。活性炭在早期的研究中易出现肺梗塞和出血倾向，以后出现了活性炭微囊以及将此微囊固定在氨基甲酸乙脂膜上等形式，使其发展较快。树脂对于有毒物质的清除有专一性能，因此是有前途的吸附材料。

　　4、组合型人工肝的动物试验与临床应用

　　尽管组合型人工肝有不同的类型，但基本结构是相似的，即血或血浆进入到含有肝细胞的生物反应器中，再返回到病人血中，其循环上再加上一个辅助解毒的装置。第一个临床试用组合型人工肝的是Matsumura，他于1987年报道了用血液透析装置内置兔的肝细胞，治疗了一例没有手术的胆管癌患者，使其胆红素下降并使肝性脑病得到了改善。次年Uchino等报道了用组合型人工肝治疗无肝犬，他用犬的肝细胞培养在胶原覆盖的硼盐玻璃器皿中，然后置入丙烯酸的容器中，证实了合成尿素，糖原和白蛋白的功能达两周，并维持凝血酶原时间、氨的代谢在正常水平，使无肝犬存活65小时[15]。而最近研究最多的是Rozga他于1994年报道了组合型人工肝的临床应用，1995年报道了用人工肝治疗8例急性肝细胞衰竭患者，其中前3例用的是生物人工肝，后5例用的是组合型人工肝，皆取得了好的临床效果。1997年Watanabe与Rozga等报告了用组合型人工肝治疗31例严重肝衰的病人，所用的装置是将5×10/ml猪肝细胞粘附在胶原覆盖的葡萄糖微载体上，再接种到由醋酸纤维素制成的中空纤维壁外间隙；当病人血浆分离后先经过纤维素包裹的活性炭吸附，再灌注到中空纤维管内循环。另外在装置中配有温度调节和氧合装置以便为细胞提供生理环境。所有病人分为三组：第一组为暴了性肝功能衰竭患者，共18人，经治疗后16例成功地用人工肝作为桥梁而行肝移植术，一例病情恢复后没有行肝移植，另一例死于伴发严重的胰腺炎；第二组有3人，为肝移植后的最初无功能患者，皆成功地用人工肝作为桥梁而实行了肝的再移植术；第三组有10人，为慢性肝脏疾病的急性恶性化，治疗后有2例病人肝功能恢复后成功地行肝移植术，其它8人虽用人工肝得以支持，但因不适合行肝移植而死亡。这是互到目前为止临床应用组合型人工肝最令人鼓舞的结果。

　　5、组合型人工肝的问题与展望

　　5.1 问题

　　尽管组合型人工肝可以提供体外解毒、代谢、合成和调节功能，但仍有以下问题：（1）仍然不知道用何种来源的细胞为佳；（2）分离后的肝细胞怎样才能维持分离前的高度分化形式和活性；（3）对异种肝细胞的排斥反应未完全解决；（4）由于人工肝需培养大量的肝细胞，而生物反应器未按比例地发展；（5）目前生物反应器的膜设计是为其它方面的用途，而不是专为满足肝功能辅助装置的需求[12]；（6）生物反应器的设计迄今为止不太注意流体力学、几何学以及细胞量在生物反应器上分布；（7）对急性肝功能衰竭的病生理了解不够，如不了解某些因子的特性，很难推测限定这些因子运输的因素，也不可能制造出理想的膜[17]。

　　5.2 展望

　　今后，理想的组合型人工肝是最有希望的人工肝辅助装置[4.10.18]。下列几个方面需加以发展：（1）发展具有分化功能的正常人类肝细胞系，有能力扩增胎干或成人肝细胞以诱导它们的分化功能，以使用于人工肝装置中，在这方面基因工程是有希望的；（2）在细胞培养中通过用新型的基质、生长因子以及与其它类型的细胞共同培养，将肝细胞聚集成球形或细胞簇来增强肝细胞的分化功能[19]；（3）改进肝细胞的冷冻保存技术，以便容易运输这一装置；（4）新型的生物反应器应相当准确地按比例发展，并应注意流体力学；（5）生物反应器的膜设计应满足人工肝辅助装置的需求，且应有专一性；（6）加强对肝功能衰竭的病生理研究，以能设计出更合理的人工肝辅助装置；（7）发展灵敏的测定肝功能方法，并用严格的临床随机对照，以便更好地评价人工肝辅助装置[20]。

　　总之，人工肝辅助装置是一个综合性复杂的研究课题，需多学科的密切合作。我们相信未来的人工肝极有可能像人工肾曾给肾功能衰竭的治疗带来革命性变化一样，为急性肝功能衰竭的现代化治疗提供最大的希望。

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