酪氨酸激酶受体Eph亚族的研究进展

　　摘要 酪氨酸激酶受体（RTK）参与细胞生长、分化、胚胎发育及细胞内信号传递等过程，具有相当重要的生理功能，目前发现50多种RTK基因属于14种亚簇，Eph亚族是其中最大的家族，由14具基因组成，一些基因主要在脑的发育中表达，另一些在各种组织中广泛表达，最近亚族胞外配体的发现为深入研究其生理功能打下基础，综述了Eph亚族成员的来源、表达及其配体的研究概况。

　　学科分类号 Q71

　　从细胞表面到细胞核的信号转途径是人们十分关心并不断探索的热点。具有酪氨酸激酶活性的受体（receptor tyrosine kinases,RTKs）是外界刺激信息传递至细胞核，转化成细胞效应的信号通路的关键组成，参与细胞生长、增殖、转化及胚胎发育和肿瘤形成，具有重要的生理功能[1]。所有RTKs都是膜结合的Ⅰ型糖蛋白，其结构的共同特点是整个分子可分成三个结构区，即胞外的配体结合区，细胞内部具有酪氨酸激酶活性的功能区和连接这两个区域的由疏水氨基酸组成的跨膜区，配体结合PTK胞外区域后使其构象发生变化引起受体在包膜上迁移、聚集，并形成寡聚化的受体-配体复合物，激活胞浆的酪氨酸激酶而活化，导致自身磷酸化及下游胞内底物蛋白质分子的酪氨酸磷酸化，启动不同信号途径将信号逐级传递[2]。

　　RTKs研究发展速度非常快，按其独特的结构特点，序列同源性及配体性质分类，就目前的报告统计至少已发现有50多个RTK基因分属于14个不同亚族，Eph是其中成员最多的家族，约有14个基因组成。

　　1 Eph亚族受体的的结构与分类

　　Eph亚族明显的结构特点[3]是它们的胞外配体结合区含一个免疫球蛋白样重复序列，一个半胱氨酸富含区（有20个胱氨酸残基），后面有两个FNⅢ（纤粘蛋白Ⅲ型）重复区；在胞浆酷氨酶区无激酶插入（KI）的序列阻断，由于核区氨基酸序列尤其在各受体亚族中高度保守，对这部分序列按氨基酸同源性分析的高低做为建立种系发生树（phylogenetic tree）的依据，从中可以得出各亚族成员关系（图1）[4]。同源性基因间序列同一性大于88%的归于一种，从而将已克隆的40多个基因归于14种，尽管Eph亚族在结构上高度保守，但各成员同源性，表达分布与结合配体各不相同，据此又可将其分成EphA和EphB subgroup.这几年来对Eph亚族的研究蓬勃发展，突出成就在于不断发现和克隆新的成员及配体，证实Eph亚族的基因区域化表达与神经轴突束的组织趋化性发育途径有对应关系，从而与脑区的形态结构以及神经网络结构的形成密切相关。

  　Eph亚族的命名[6]源自该亚族最早的成员Eph（新命名EphA1），是Hirai用非严谨杂交技术以vfps的酪氨酸激区序列为探针从人杆细胞癌细胞株cDNA文库中克隆[3]。Eph基因在进化上高度保守，用人Eph cDNA探针可从大鼠、鸡、小腹果蝇中检测到特异DNA带，人Eph基因定位于7号染色体，编码3.5kb Mrna,RNA印迹分析表达在大鼠肝、肺、肾有Mrna水平高表达，在小肠表达较低，在几种人肿瘤中（肺癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌、结肠癌），Eph表达高于相应正常组织，但无基因扩增，且高表达的Eph基因体外使NIH3T3诱发裸鼠致瘤及能在软琼脂上形成克隆[4]。提示Eph高表达也许与肿瘤发生有关。

　　1.2 Elk(eph-like-kinase)

　　Elk（新命名EphB1）是该亚族第二个成员，是用抗磷酸酪氨酸抗体从大鼠的脑cDNA文库中克隆[7]，它的表达与eph不同，仅大鼠脑中检测到ElkmRNA，在小肠中表达较少，lwase[8]通过RNA印迹分析表明Elk在14至16d大鼠胚胎胃中表达高，至18d及新生鼠中表达非常低，在成年鼠胃中没有检测到Elk表达，在3例人胃癌组织中发现有2例Elk的mRNA表达水平几倍高于正常胃组织，推测Elk也许在人胃癌中起一定作用。

　　1.3 Eck(epithelial-cell-kinase)

　　Eck（新命名EphA2）是该亚族第三个发现并克隆全长cDNA的成员，来源于人角化细胞cDNA文库，并由此得名，它广泛表达与上皮来源细胞中[9]，其4.7kbmRNA在大鼠肺、皮肤、小肠和卵巢及上皮性细胞系高表达，在肾、脑，脾等有低水平表达， eck是该亚族成员被发现有酪氨酸激酶活性的第一个基因，用免疫沉淀方法以抗Trp e融合蛋白（含 Eck C端101氨基酸），并将免疫复合物进行体外激酶实验，对磷酸化蛋白进行磷酸氨基酸分析，确证了其磷酸化主要是在酪氨酸上。

　　1.4 Heks(human eph-like-kinases)

　　Heks( Hek4,5,7,8,11)[10]。是从人胚脑cDNA文库中用PCR和5'RACE方法克隆出来的一组基因，采用的是根据该亚族高度保守的胞内催化功能域WTAPEAI和VCKVSDFG基序而设计合成，氨基酸同源性分析表明 hek4（新命名EphA3）与cek4(99%)和mek4(98%)同源性最高，即它们的同源基因，编码983个氨基酸，有典型的ATP结合位点（GXGXXG），其779位Tyr为自身磷酸位点，主要在人胎盘、心、脑、肺、肝组织中表达，还在两株T白血病细胞株（JM，HSB-21）和一株前B细胞株中表达，另外在1/28慢性淋巴细胞白血病及2/39急性髓细胞白血病表达，表明它在正常淋巴系统的功能和分化中及一些人恶淋巴肿瘤中有一定作用。

　　Hek5（新命名EphB2）即以前命名的Erk(Elk-related kinase)基因[11]，与ERK蛋白（extracellular signal-regulated kinases）是不同的，后者在MAPK级联中可被MEK磷酸化，Iwase胞内激酶区的片段，通过RNA印迹分析表明Erk在鼠中表达降低，而成年鼠的胃的中已检测不到该基因表达，而且首次在人胃癌组织中检测到Erk表达显著高于相应正常组织，故而认为Erk了也许在胃的胚胎及肿瘤发生中起一定作用。随后Kiyodawa等[12]的研究更证实了这点，他们用此cDNA片段做探针克隆出全长Hek5序列，与其他Eph亚族基因氨基酸序列比较，在氨基端有一个不完全信号肽区，与Cek5（92.5%）,Nuk(91.1%)同源性最高。Hek5主要在上皮来源的组织（甲状腺，结肠等）及肿瘤细胞系（胃癌、食道癌、结肠癌等）表达，另外在非上皮来源的骨肉瘤细胞系Huo-3NI有表达，在各种肿瘤组织中的表达均几倍高于相应正常组织，其中胃癌显著75%高表达，未发现扩增及重排。

　　Hek5的鸡同源物cek5(chicken embryo kinase)是从10天龄鸡胚cDNA表达文库中用抗磷酸酪氨酸抗筛选出来，蛋白质印迹表明Cek5在鸡胚脑中高表达，在肾、肺、肠等低表达，另外，同时还得到了一个Cke5异型体（Variant）Cek5+的部分序列，发现它在膜并列区域多了16个氨基酸的插段，也许是选择剪切（alternative splicing）不同的结果，并且这是神经系统特有的，与此类似，Cek10(新命名EphB3)也有异型体Cek10+,在膜并列区域有15个氨基酸的插段[13]，目前对这种现象还所知甚少。

　　1.5 其他新基因

　　Tck,(tail and cement gland kinase),XElk,P17a[14]是从非洲蟾蜍克隆出来，分别与Hek2（79%）、Elk(91%)、Myk-1(80%)同源性最高，XElk是Elk的蟾蜍属同源物，Tck xElk均在卵母细胞成熟过程中有不同程度表达，故推测在特定组织胚胎发育的信号传导中起一定作用。

　　2 Eph亚族受体的配体研究

　　阐明Eph亚族各成员的生理功能及研究信号转导途径的第一步依赖于配体的分离，目前已分离出8种不同的配体分为ephrin-A和ephrin-B subclass(Eph family receptor interacting proteins).ephrin-A(A1～A5)类配体靠糖基磷脂酰肌醇链（GP1-linkage）锚定在细胞膜上，PI-PLC能水解GPI，使其从细胞表面释放下来具备可溶性；ephrin-B(B1～B3)类配体是跨膜蛋白，结合研究表明该亚族已发现的配体可与多个受体以不同的亲和力交叉结合且发挥不同的作用[15]。配体在组织中的表达广泛，其结构可分为四个区即信号区、结合区、spacer区、疏水区、胞外区有四个保守的半胱氨酸残基和一个推测为糖基化的位点，及受体的结合位点，结合区有9个β-extended构象，也许存在类似Ig折叠的β-sheets构成的二级结构，疏水区有信号通过GPI连接或跨膜形式将蛋白锚定于膜上，Spacer区使受体结合区从质膜伸展开。二级结构分析表明这些配体不属于已知的结构基序，与其结构相似最高的大多为T细胞受体或Ig序列[16]。配体与受体的结合能导致受体自身磷酸化和与细胞中信号蛋白分子的作用。

　　B61（新命名ephrin-A1）是该亚族第一个发现的配体，早先是从IL-1或TNF诱导的人脐静脉内皮细胞中克隆的立早反应基因，存在可溶和以GPI锚固定于膜上二种形式，研究发现后者是Eck配体可结合并激活Eck，原位杂交分析表达B61和Eck均在肺和内脏高表达，B61基因位于小鼠3号染色体[17]。随后又证实它与另一个新发现的配体LERK2（新命名ephrin-B1）一起能与Elk和hek结合[18]。对配体的研究发展也非常迅速，越来越多的配体被发现， park用非严谨PCR克隆技术来克隆B61的同源基因，结果从鼠脑中分离出3个不同的配体Elf-1/cek7-L(新命名ephrin-A2),Ehk1-L/Ef1-2/Lerk3（新命名ephrin-A3）和AL-1/RAGS（新命名ephrin-A5）可激活Eek[15]。

　　随着越来越多配体的发现对功能的研究得以深入开展，Ciossek发现Elf-1和B61两种配体与MDK1结合能导致其自身磷酸化和Rat1细胞中一个未知的内源62ku蛋白质酪氨酸磷酸化，这也许表明MDK1及其配体在鼠早期发育中起作用[19]。应用双杂交系统证明在P19胚癌细胞株中，EphB1(ELK)被其配体ephrin-B1/Fc活化后可与胞内接头蛋白Nck的SH2结构域结合，进一步激活c-Jun激酶（JNK/SAPK），而瞬时高表达突变的EphB1受体（Y594F）则阻断了EphB1到JNK的信号传递，从而证明了Nck是介导EphB1到JNK信号通路的重要连接分子[20]。鉴定所有配体及阐明它们的功能是今后面临的挑战性任务。

　　Eph是一大类新发现的RTK，现代分子生物学技术的发展使Eph亚族迅速壮大成为RTK最大的家族，昨天其广泛的种属和组织分布，结构上的高度保守，提示它们在细胞内具有重要的生理功能，尽管有研究表明，Eph亚族参与神经系统的细胞间相互作用及轴突发育路径，Eph、Hek、Erk、Elk等与人肿瘤有关，但Eph亚族的研究尚处于资料和认识的积累阶段，即仍需大量研究加以证实。克隆Eph亚族新基因及继续寻找胞内各成员的天然配体及特异底物范围及生理功能，为最终阐明它的信号传导机制及生长调控、神经系统发育、肿瘤发生的关系提供满意答案。

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Progress in the Studies of Eph-subfamily Receptor Tyrosine kinases.

ZHANG xiao-Guang.YAO Li-Bo, SU Cheng-Zhi

( Department of Biochemistry and Molecular biology,the Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,China)

　　Abstract Receptor tyrosine kinases(RTSs) are involved in many different processes including cellular growth,differentiation,embryonic development,oncogenesis and intracellular signalling pathways,thus possessing improtant physiological functions,There are now more than 50 distinct RTK genes that have been published and divided into 14 sub-families, the largest one knnwn is the Eph sub-family which is comprised of at least fifteen members Some of the Eph family members are predominantly expressed in the developing brain,the others are expressed in a broader range of tisues .Recently the findings of the excellular ligands of this family should facilitate further studies of its function .The isolation,pattern of expression and the ligands of Eph-like receptors are summarised.

　　Key words receptor tyrosine kinase( RTK),Eph-subfamily,ligand