分子生物学检测在HP感染中的应用

　　摘要 大量的临床和流行病学资料均提示HP感染是慢性胃炎和消化性溃疡的主要病因，与胃癌的发生也有密切的关系。HP感染的检测方法有：细菌培养法、直接镜检法、染色法、尿素酶法、免疫学法和呼吸试验等。随着分子生物学技术的发展，其在HP感染研究中的应用越来越广泛。

　　1 核酸杂交技术

　　wetherall等于1988年最早用斑点膜杂交法将幽门螺杆菌HP基因组探针用于HP检测，并与32P、生物素、光敏生物素及半抗原磺基基团四种标记探针进行比较，结果显示：32P、生物素及磺基标记探针的灵敏度为100pg靶DNA，相当于5×104个细菌，而光敏生物素标记探针的灵敏度较上述3种探针低100倍（10ng靶DNA），32P及磺基标记探针的特异性为100%，生物素及光敏生物素探针则与结肠弯曲菌、海鸥弯曲菌等近缘菌有弱交叉反应。Owen等[1]用HP的rRNA基因作为探针，可检出该菌rRNA基因限制片段。Van den Berg等用生物素标记的HP基因探针建立了检测HP的原位杂交技术，证实该探针对HP具有较好的特异性，并可检出组织学阴性的标本。研究结果表明，HP的原位杂交技术较常规方法敏感，即使切片不经复染或HP数量较少时，原位杂交技术也能检出HP，甚至细菌碎片、DNA片段等，在HP的分子流行病学调查及评价治疗反应时具有重要价值。

　　morotomi等用人工合成的HP特异性寡核苷酸探针同HP的16S rRNA序列互补，证实这种探针比较敏感，其检测灵敏度为5×103～1×104个细菌，与23株HP均有交叉反应，而与和HP的16S rRNA序列同源性很高的近缘菌均无交叉反应，特异性为100%，杂交结果和尿素酶试验完全一致。于青琳等[2]用生物素3′端加尾标记的16S rRNA寡核苷酸探针，用链霉素亲合素-碱性磷酸酶染色，其灵敏度可达10pg靶DNA。用已知螺杆菌属细菌，如猫螺杆菌、猪螺杆菌16S rRNA核酸序列中共同的一段基因序列，合成互补的螺杆菌属序列宏伟核苷酸探针，可鉴定动物胃的螺旋样细菌[3]。Fox等用属特异探针互补于HP16S rRNA的第274～300核苷酸，可与已知的所有螺杆菌属细菌杂交，而与其它近缘菌无交叉反应[4]。显示寡核苷酸探针在杂交配对中严格的优点，在HP感染的流行病学研究中具有重要的价值。

　　2 聚合酶链反应（PCR）

　　pCR是一种模拟天然DNA复制过程的体外基因扩增特异DNA片段的新技术，其扩增产物以指数方式增加。Valentine等[5]报道PCR可拉增仅一个靶拷贝的HP质粒DNA，与寡核苷酸探针相比，其灵敏度至少高出100倍。用套式PCR可合成与扩增产物内部序列互补的寡核苷酸探针与扩增产物进行杂交，均可使灵敏度提高10倍，即使低至1个细菌的靶DNA也能检出。用PCR检测50株从胃粘膜活组织中分离的HP菌株均产生450bp片断，其敏感性为0.1pg的HP dNA，相当于100个细菌细胞，而12株非HP菌株及无HP感染的人胃粘膜细胞均为阴性。有学者[6～8]用用PCR扩增HP及与其相类似微生物的16S rRNA，以此来识别HP。Engstrand等[9]选用16S rRNA引物，采用反向转录PCR技术，利用反转录酶合成RNA，然后再扩增cDNA，其敏感性比常规PCR提高25～50倍，可检测到两个细菌。检测15份标本，14份标本与呼气试验和培养相同，其特异性为100％。Hammer等[10]采用了编码HP特异蛋白质的部分核苷酸序列为引物，27例胃粘膜标本中，19例PCR阳性，而在所有PCR阳性标本中只有15例培养阳性。Valentine等[5]检测了13例胃粘膜活检HP阳性患者的胃液，结果11例阳性。而采集胃液比采集胃粘膜方便，只需鼻胃管即可，对那些不易作内窥镜的患者和儿童可能是一种比较易被接受的检测方法。宋敏等[11]用PCR检测29份胃活检标本中的HP，其结果与细菌培养、尿素酶试验和组织学方法完全一致。这与Hammer等[10]的的结论类似。Li等[12]直接检测唾液中HP获得较好的效果。也有用PCR技术在粪便中检测到HP dNA的报道[13]。研究结果表明，PCR可成功地检测人胃粘膜以外的用常规方法不能检出的HP，包括牙斑、唾液、胃液、粪便等标本中HP DNA。因此，对环境、宠物和人的上述标本中HP dNA检测，有助于明确HP的流行病学特征。

　　用套式引物双扩增或同时在引物扩增序列内选择寡核苷酸作探针，对PCR扩增产物进行Southernblot检测，可使敏感性增加10～100倍，可检出难以培养的球形HP。PCR单链构象多态技术，不仅可用于大规模的流行病学检查，而且能准确评价治疗后再现的HP是复发还是再感染，并可了解HP的特征，如家族内传播。国内对17例经不同方案治疗后再用尿素酶试验、银染色及培养等常规方法均阴性而被认为HP根除者，用PCR检查发现4例HP阳性。以前对某些用常规方法不能检出而实际还存在HP的病人，误认为HP被根除而放弃治疗，这些病人短期内HP的再现，实际是治疗不彻底，而不是新菌株再感染。因此采用PCR。