幽门螺杆菌工程疫苗研究进展

    幽门螺杆菌(HelicobacterPylori，Hp)是慢性胃炎、消化性溃疡及胃肠道淋巳瘤的主要致病因素，并与胃癌发生密切相关，WHO将其列为第一级致癌物质[1]，流行病学调查表明，我国是胃癌癌的高发区及Hp高感染区(21％～93％)，已对人民健康造成重大危害，尽管抗生素治疗在HP相关性疾病治疗方面取得了较大进展。但其毒副作用明显，疗效不稳定，无法解决其复发问题，人类与病原微生物的长期斗争历史表明，有效控制和彻底消灭某种传染病的最佳途径是疫苗接种，Hp疫苗接种将是预防Hp感染，降低Hp相关性疾病发病率的最佳选择[2]。1995年费城会议上Rapuoli指出开发Hp疫苗需要至关重要的三种成分：①必须现能干扰粘附和毒性且存在于所有菌株的保护性抗原。如尿素酶(Ure)、热休克蛋白60(Hsp60)、粘附素等；②临床前试验需要能模拟感染和疾病的动物模型，一种新的Hp感染小鼠需要新鲜的临床分离株来感染小鼠，这一模型能重复人体疾病的诸多临床表现，如上皮细胞损害和炎症等；③需要有适用人体的粘膜佐剂，比较肯定的有霍乱毒素(choleratoxin'CT)B亚单位(CT-B)、大肠杆菌热敏毒素(heatlabiletoxinofenterotoxigemicE-coli，LT)B亚单位(LT-B)等．1抗原基因的选择研究疫苗的首要任务便是寻找免疫原，Lazowskaetal[3'4]在HP蛋白免疫原的寻找方面作了较为出色的工作，最初应用全菌抗原和膜佐剂口服免疫Hp感染的小鼠，成功诱导小鼠保护性免疫反应，但全菌抗原成分复杂，副反应多，研制Hp亚单位疫苗成为必然．HpUre基因组，由A，B，C，D四个亚基基因组成，基因结构已清楚，其中A，C，D亚基免疫原性差，其免疫保护作用十分微弱，仅有UreB亚基能产生保护性免疫，是疫苗和诊断用抗原的主要候选基因之一[5]；CagA基因较大，编码分子量94KD的细胞毒性相关蛋白，是Hp的主要致病因子．因此研究UreB或(和)CagA相关的疫苗将能有效预防致病Hp的感染和发病，Ure作为候选菌苗有许多优点[6，7]：它在菌株中含量丰富(占Hp可溶性蛋白总量的6％)，分布在细菌表面，广泛表达和高度保守；其大分子量和颗粒状结构也更有利于粘膜免疫接种。Pappoetal用纯化的Helicobacterfelis(Hf)UreB亚单位和CT口服免疫小鼠后可抗Hf定植，而UreA亚单位则无保护作用，UreB亚互单位和LT口服免疫小鼠，同样产生抗Hf感染保护力，重组的Ure和LT口服、鼻腔、直肠免疫同样能够诱导小鼠产生免疫保护力[8]，Ure抗体被动免疫小鼠后也能预防Hf感染的事实，间接说明Ure诱导产生的免疫保护力是体液免疫应答介导的，螺杆菌属的Ure同源性非常高，HpUreB亚单位和佐剂CT口服免疫小鼠可抗Hf感染的事实，说明螺杆菌属的Ure存在交叉性表位，免疫后可引起交叉性保护，目前在小鼠模型上已证实多种Hp抗原包括VacA，Ure，CagA，过氧化氢酶、HpGroES类蛋白等。都可诱导小鼠产生免疫保护力。疫苗能否清除已有的感染？Doidge采用Hp超声裂解物和重组UreB亚单位，结合CT口服免疫慢性Hp感染小鼠，结果证实口服免疫兼具预防和治疗双重作用，Doidge在Hm(Hmustelac)感染的雪貂中也发现类似结果．Ghiaraetal[9]研究了Hp相关抗原作为疫苗治疗慢性Hp感染效果，同时也试验大肠杆菌突变脱毒肠毒素(LTK63)作为粘膜佐剂的可能性，结果表明不管是Hp超声裂解物或者重组蛋白VacA和CagA，与UTK63一起免疫，都成功地清除了小鼠体内已有的Hp，并且免疫3mo后仍无感染，Marchettietal[10]实验了LT，LTK63佐剂与全菌、内源性VacA，Ure，CagA及重组VacA，CagA的免疫保护作用，发现都可激发小鼠产生免疫保护[11]．2关于佐剂粘膜免疫需要强的佐剂以提高抗原的免疫原性，粘膜佐剂可刺激Th2型粘膜免疫反应．未来的Hp疫苗必须辅以能有效诱导粘膜免疫的佐剂，活化Th2细胞免疫途径，才能产生大量的slgA，才能克服Hp抗原性弱的问题．CT和LT是目前研究最为深入的粘膜免疫佐剂，它们都具有较强的粘膜免疫原性和粘膜佐剂效应，与不相关可溶性蛋白抗原同时口服免疫机体，能消除机体对这些免疫蛋白的耐受性，诱导机体产生针对CT及其免疫蛋白的长期免疫记忆．它们都能促进抗原递呈细胞的抗原呈递，选择性诱导抗原特异性Th2细胞应答，促进上皮内淋巴细胞的有丝分裂和B细胞种型分化，但由于CT口服时在某些品系小鼠诱生超敏反应，而改用CT-B单位即可避免，故有人认为CT-B是至今为止最为有效最为安全的粘膜免疫佐剂之一，目前人们更为亲睐LT-B，因为LT-B较CT-B拥有更可靠的安全性和有效性，Michertietal[12]在临床实验了重组HpUre和LT口服免疫Hp染的志愿者的安全性和免疫原性，结果发现治疗患者仅出现腹泻等，较少的副反应；而使用脱毒LT(如LTK63)可避免以上副反应．LTK63与LT区别在于丝氨酸取代了第63位的赖氨酸，LTK63作为粘膜佐剂在动物模型上已成功诱导抗原特异的体液免疫反应和风疹病毒特异的毒性淋巴细胞反应，因此LTK63作为佐剂完全可能在未来临床中用于Hp治疗性免疫。最近Kinetal[13]采用聚微囊包襄的全菌抗原口服免疫小鼠同样可诱导小鼠产生强烈的系统和粘膜免疫，免疫8wk后，胃肠液中抗HPslgA和血清lgG仍维持较高平，Hp菌攻击小鼠保护率高达95％，与CT，LT佐剂组对比无显著差异，表明聚微襄颗粒可以诱导针对Hp特异系统和粘膜免疫，并且可以作为未来Hp疫苗的佐剂。3关于疫苗蛋白质分子的空间结构及抗原表位预测抗体分子在抗原上的结合位点称为抗原决定簇(determinant)，又称抗原表位(epitope)．它是蛋白质的表面性质，常出现在分子的高暴露区域，其性质、数目及空间的构型决定其抗原特性，为精确描述抗原决定簇，可用同源蛋白质来评价特定氨基酸替换的影响以确定抗原表位的所在区，不过这里的表位是指“功能表位”，即一种蛋白质能在免疫检测中结合抗体的那一部分或片段、因此研究某种蛋白质有意义的亚单位结构和功能，它在实验使用上有买际意义。利用计算机软件可以预测蛋白质的空间结构和抗原位点，这可作为抗原多肽合成试验的选段参考，适当左右扩展成10～ 20肽，也可用作抗原克隆表达实验前PCR引物设计时模板范围选择的参考，使扩增出的序列能够覆盖较多的预测点，这对我们研制Hp基因工程疫苗有重要指导意义。4Hp疫菌的免疫保护机制免疫应答类型的确定直接决定人类疫苗学研究发展，Hp感染的免疫应答类型很难确定，这是因为自然感染Hp后，引起的免疫反应无保护性；而感染Hp的啮齿类动物，采用经典免疫学技术很难分析疫苗的治疗性免疫应答机制[14]．最近有报道在Hp感染者胃粘膜中slgA水平明显高于对照组，提示粘膜slgA在抗Hp感染中具有重要作用，Doigeetal用Hf超声裂解物免疫小鼠，发现抗螺杆菌slgA水平与保护作用密切相关．T淋巴细胞在Hp感染中的保护作用目前知之甚少．Hp感染患者外周血单核细胞的刺激和抑制作用已有报道，Hp感染的小鼠和人类，THI细胞被抑制，小鼠的保护性免疫与THI细胞抑制和TH2细胞活化密切相关[15，16]．目前Hp疫苗诱导机体产生保护性免疫和治疗作用的机制仍不清楚，Ghiaraetal[9]认为疫苗可能改变胃内Thl型应答反应，转变为THO或Th2型保护性反应；并且在慢性Hp感染小鼠模型中出TH1细胞反应口服Hp菌苗诱导THO或Th2细胞活化反应，清除体内感染的细菌，Hp感染的小鼠模型研究发现Th2反应刺激程度与胃粘膜内细菌减少和胃炎消退密切相关，Hp免疫小鼠体内发现IFN-γ下清Thl反应，胃内Th2细胞分泌IL-4水平增高；体外培养Hp免疫小鼠后，发现大量脾细胞中有Hp特异Th2细胞，脾细胞接种其他动物(与对照相比)发现明显减少胃内Hp感染量．Mohammadietal[17]也发现相似结果，并证明IL-4基因敲除小鼠体内Hp感染数量明显高于对照组，目前研究表明Hp慢性感染人群Thl细胞反应占主要地位，人类胃粘膜反应是否与小鼠相同？如果类似，采用无毒粘膜佐剂，治疗性疫苗可能是清除Hp感染的新的方法[18，19]。5Hp感染的动物模型研制Hp疫苗的先决条件是必须建立合适、稳定的Hp慢性感染动物模型，以分析免疫应答和免疫保护机制．在螺杆菌属细菌中，Hf与Hp的生化特征和生物学行为最为接近，其16sDNA基因序列与Hp的同源性高达94．6％，Ure、过氧化物酶、过氧化氢酶均为阳性，生长条件相近，还具有相对较广的宿主范围，Hf在小鼠胃内的定植无明显部位特异性，与人Hp胃内定植部位基本一致，并能引起与人类Hp相关胃炎相似的病理改变．王继德博士etal(1997年)研究证实无特殊病原菌(SPF)级Balb／c小鼠对Hf易感，25只小鼠的感染成功率为100％，并能在胃内长期存活达16wk以上，用ELISA法在感染16wk以后的小鼠血清、胃肠液中可检出抗Hf-lgG抗体，并发现该抗体与Hp抗原有明显的交叉反应，这证明两种细菌有许多共同免疫原，Hp定植成功的有悉生猪、狗和无胸腺小鼠．但这些动物昂贵，需特殊饲养条件，且允许观察时间不足1mo，国内学者陈晶晶1990年最早报道了Hp的wistar大鼠模型的成功复制，但不足之处在于Hp定植时间不超过1mo．有报道用灵长类动物(如日本猴、罗猴)复制Hp模型，由于灵长类动物胃内生理结构与人类高度相似，可望获得长期感染，但该纯系动物不易获得，饲养困难，价格昂贵．另外由于Hp的动物宿主谱较窄，其动物感染模型尤其是常规小动物长期感染模型的建立，向未兄有成功的报道．故人们在研究中广泛应Hp的近缘菌感染小动物模型，Hf小鼠模型是最常用的一种。6Hp减毒沙门疫苗沙门菌(Salmonella)是寄生于人和动物肠道的革兰阴性菌，它可以作为其他病毒、细菌、寄生虫等病原体的蛋白、抗原或表位的表达载体，向机体输送单价或多价抗原，诱发系统免疫和粘膜免疫，沙门菌通过其自然感染方式经过粘膜侵入呼吸道、消化道、雌性生殖道等粘膜淋巴组织，M细胞摄取和运输抗原．触发粘膜免疫反应，剌激slgA特异的B细胞向其他粘膜组织迁移并分化成浆细胞，分泌slgA释放到粘膜表面，防止病原体再度感染[20]．此外沙门菌也可随血流分布到机体的肝、脾和淋巴结等处，寄居在单核巨噬细胞中，激发机体的免疫应答，减毒沙门活菌疫苗表达的外源蛋白，无论采用口服免疫、鼻腔免疫、直肠免疫或阴道免疫，都能诱导哺乳动物产生显著而特异的免疫应答，包括全身和粘膜的体液免疫应答。目前沙门菌载体菌苗系统常见的突变株包括：Ty21a'aro，asd'cya'crp等突变株'其中aro基因(aroA，aroC，aroD)突变株不仅高度减毒，而且具有良好的免疫原性，被广泛用作表达多种异源抗原的载体，而cya'crp突变株不仅减毒具有免疫原性，而且是双基因突变，回复突变的可能性极小，因此用该突变株作为载体菌苗很安全[21]。目前减毒沙门菌疫苗研究多利用其天然宿主-小鼠来研究外源蛋白的免疫源性，人类应用减毒沙门菌疫苗也取得了令人鼓舞的成果，目前Hp减毒沙门菌苗载体多为沙门菌突变株，如aro(生物合成缺陷型)、phoPc(表达系统调节子缺陷型)等[22]．Gomez-Durateetal用表达HpUreA，B亚单位的减毒沙门菌SL3261aro突变株(有可诱导的增强子nirB)，口服免疫Balb／c'C57/B6小鼠，然后用野生株攻击，免疫组获100％保护，对照组则无保护作用，血清、胃粘液中抗Ure抗体均升高，说明减毒沙门菌能表达强免疫源性UrE[23]．Corthesyetal[24]用表达Ure的phoPc突变株鼻腔免疫小鼠也获得了满意的保护率，能诱导体液吏疫和细胞免疫，并刺激T细胞增殖、分泌IFNγ，IL-2．IL-4，IL-5，IL-6等细胞因子，说明沙门菌表达的Ure特异诱导了Thl，Th2等淋巴细胞反应。但是Hp减毒活疫苗的研究尚有许多困难待克服：①宿主对Hp减毒沙门菌苗的免疫应答机制及Hp菌逃避甚至破坏机体的免疫应答机制尚不清楚；②需进一步提高减毒沙门活菌疫苗的安全性和免疫原性；③研制稳定、高效表达Hp精制亚单位抗原的减毒沙门活菌疫苗．Hp感染与溃疡和胃癌的相关性己广为接受，耐药苗株不断增多以及发展中国家Hp感染率不断增高的事实，使我们只有寄希望于疫苗来根治和预防Hp感染．国外Hp疫苗的研究已进入临床前期试验[5，25]．因此我们研制价廉、高效，兼具预防和治疗作用的疫苗已迫在眉睫．Hp菌体抗原成分复杂，含有多种外毒素致病因子，全菌粗制抗原易于引发不良反应，Hp又难以大规模生产性培养；另外Hp减毒活疫苗的研究有许多问题待解决，目前正重点进行组分疫苗及基因工程疫菌的研究，因此寻找和筛选的致病新基因是其疫苗研究工作的重点，由于任何一种Hp成分作抗原其免疫原性都较弱，因此联合佐剂的亚单位疫苗能克服全菌疫苗的诸多不足；尤其是与佐剂一体化的亚单位基因工程疫苗的研究，是Hp疫苗研究的主攻方向之一。

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    作者单位：中国人民解放军第三军医大学西南医院消化利 重庆市 400038