原代培养人胎肝细胞体外感染HBV的研究

　　摘　要：目的建立HBV感染人胎肝细胞体外培养系统。方法首先分离、培养人胎肝细胞，然后应用HBV阳性血清感染体外培养的人胎肝细胞；每隔2d收集上清液和肝细胞，应用ELISA,免疫组化法、原位杂交法和斑点杂交法检测上清液和细胞中HBsAg和HBV dNA。结果 上清液中HBsAg在感染后2d～20d均可测出，以感染后4d～16d达高峰(A值在0．22左右)。免疫组化检测细胞中HBsAg呈阳性表达，原位杂交和斑点杂交检测细胞和上清液中HBV dNA也呈阳性表达。结论 HBV在原代培养人胎肝细胞中能稳定复制和表达至少达16d。

Primary human fetal hepatocytes with HBV infection in vitro

Ye Gui Jiang ,Oi Fen Li,Oing Mao ,Yu Ming Wang(Centre of lnfectious Disaases,Southwest Hospital,Third Military Medical university,Chongqing 400038,China)

　　Abstract：AIM to establish a culture systmn of HBV-infected laznan fetal hepatocyte in vitro.METHODS Human fetal hepatocytes were isolated and cultured, then infected with HBV positive serum in vitro.Supematant and cells were collected every 2 days. HbsAg and HBV DNA were detected by ELISA, immunohist-ochemistry, in situ ybridization and dot blot hybridization in cells and supematant.RESULTS HBsAg could be detected from day 2 to day 20 after HBV-infection in supematant and hepatocytes.Secretion of HBsAg reached submit from day 4 to 16 after hBV-infection in supematant (A value: abcut 0.22).HBsAg could be detacted by immunohemistry incells. HBV DNA could be detected by in situ hybridization and dot blot hybridization in cells and supernatont.CONCLUSION Primary human fetal hepatocytes are cumpetont for infectlon with HBV. HBV can stably replicate and express In HBV-infected human fetal hepatocytes,and at least this replication and expression can last 16 days.

　　Keywords：hepatitis b virus; HBV infection; human fetal hepatocyte; cell culture

　　0引言目前，有关HBV的研究，主要是利用HBV基因转染细胞株，但这些细胞株不能完全模拟人体肝细胞的生物学功能，用于研究HBV时，不能完全代表体内情况。用人胎肝细胞作为感染对象，建立HBV感染人胎肝细胞培养系统，可解决上述不足，我们应用HBV感染人胎肝细胞，初步建立了HBV感染人胎肝细胞体外培养系统。1材料和方法1．1材料人工流产22周龄儿肝脏，经体外两步灌流法分离肝细胞，台盼蓝染色人胎肝细胞成活率达90％以上．HBV感染血清取自本科一慢性乙型肝炎患者，ELISA检测HBsAg(+)，HBeAg(+)，抗—HBc(+)，血清斑点杂交HBVDNA(+)，甲、丙、丁、戊、庚型肝炎病毒标志均为阴性。1．2方法采用王宇明etal[1]设计的体外两步灌注法首先分离出总肝脏细胞悬液，再以差速离心方法分离、纯化肝细胞。将分离的人胎肝细胞用含100mL／L小牛血清(FBS)的RPMI1640培养液调整细胞密度为4x108/L，接种于24孔塑料培养板内．每孔含培养液0．5mL(即每孔含细胞数为2x105个)，每24h更换培养液．培养48h后，于培养液中加入HBV感染血清(终体积分数为10％)，并在培养液中加入40g／L聚乙二醇(PEG)．37°C培养16h(过夜)后，弃去上清液，细胞用RPMl1640培养液洗涤3次后(最后一次洗涤液留样待检)，加入含100mL／LFIBS和20g／二甲基亚枫(DMSO)的新鲜RPMl1640培养液(不含PEG)．每48h更换培养液(培养液组成同前)．每48h收集上清液和肝细胞。实验分为HBV感染组和空白对照组(无HBV感染)．培养人胎肝细胞于培养后每隔2d以倒置生物相差显微镜观察细胞形态变化过程及贴壁生长情况．培养上清液中HBsAg检测采用ELISA法，细胞中HBsAg检测采用免疫组化SP法，细胞中HBVDNA检测采用原位杂交法．培养上清液中HBVDNA检测采用斑点杂交法．同时设阳性对照、阴性对照、空白对照和替代对照。2结果2．1培养人胎肝细胞形态的动态变化实验前(即培养后48h)人胎肝细胞生长良好，肝细胞体积大，形态为扁平不规则多角形，细胞核清晰可见，肝细胞增殖活跃，基本铺满培养板孔底。实验组和对照组人胎肝细胞在培养后22d一直维持正常的形态结构，自培养后14d开始，人胎肝细胞逐渐死亡，脱落于培养液中。2．2HBV在人胎肝细胞中稳定复制留存洗涤液中HBsAg呈阴性，感染后所有留存系列上清液中HBsAg均呈阳性，HBsAg在感染后2d～20d均可测出，以4d～16d达高峰(图1)．免疫组化检测细胞中HBsAg呈阳性表达(图2)，空白对照组呈阴性表达．原位杂交HBVDNA呈阳性表达．上清中HBVDNA斑点杂交也呈阳性表达(图3)。图1培养上清中HBsAg含量图2HBV感染人胎肝细胞中HBsAg表达(S-P400)图3上清中HBVDNA呈阳性表达(斑点杂交法)3讨论由于乙型病毒性肝炎(HB)及其相关疾病的复杂性，对该病的多数研究必须借助体外实验进行。事实上，目前获得的有关HBV感染及复制机制、HBV基因调控、基因产物的功能等均得益于HBV基因转移或转染细胞株．但有关研究尚存在许多不足，如细胞株不能完全模拟人体内肝细胞的生物学功能，用于研究HBV与肝细胞相互作用时，不能真实反映体内情况．用人胎肝细胞作为感染对象，建立HBV感染的人胎肝细胞体外培养系统，可解决上述不足，要建立HBV感染人胎肝细胞体外培养系统，必须满足三个基本条件：①肝细胞体外培养达20d以上；②肝细胞维持良好的增殖和分化功能；③HBV能在人胎肝细胞中稳定复制表达．肝细胞在体内受到来自门静脉血流的各种激素和细胞因子的调控，其中包括表皮生长因子、肝细胞生长因子、生长激素等，这些称为门脉嗜肝因子，能够促进和维持肝细胞的增殖和分化，有学者据此设计了一种条件培养液，添加各种激素、细胞因子和微量元素，称为激素限量培养液(hormonedefinedmedium，HDM)，模拟肝细胞生长的环境，能够使原代培养的肝细胞维持良好的分化和增殖功能达50d以上[2]．HBV体外感染肝细胞培养系统的建立，国外报道较多[3,4]，国内少见报道。我们在培养液加入PEG以利HBV进入肝细胞，并在培养液中加入DMSO以促进HBsAg的表达，研究发现，感染后2d～20d培养上清中可检出HBsAg，4d～16d达高峰，以后HBsAg分泌逐渐下降，分析其可能原因：培养早期细胞增殖较快，因细胞有接触抑制特性，细胞增殖到一定程度，增殖速度变慢，最后完全停止增殖，维持一定时间后，细胞开始死亡、脱落．我们认为HBV在人胎肝细胞中能稳定复制表达，其根据：①留存洗涤液标本中HBsAg呈阴性，斑点杂交示HBVDNA也呈阴性，基本排除感染血清残留对实验造成的干扰；②细胞中HBsAg和HBVDNA均呈阳性，说明HBV已进入肝细胞；③由于每隔48h再换培养液，系列培养上清中HBsAg和HBVDNA均呈阳性，且维持较前相同或稍高水平，有一分泌高峰，说明HBV及其表达的抗原持续分泌至培养液中。HBV感染人胎肝细胞培养系统的建立虽是一初步研究，但却为HBV相关疾病的研究奠定了基础。

　　基金项目：国家自然科学基金资助项目，No-39570166

　　作者简介：蒋业贵，男，1966年12月25日出生，安徽省巢湖市人，汉族，1996年第三军医大学硕土，1999年第三军医大学博士，医师，主要从事病毒性肝炎的研究，发表论文10篇。

　　参考文献：

　　［1］Wang YM, Chen GZ, Dong JH, Yuan LP,Ding J.A metlvod of isolating hepatolytes.in uitro.Zahonghua Xiaohua Zazhi,1994;14:175

　　［2］Rumin S,Gripon P,Seyec JL,Corral-Debrinski M,Guguen-Guillouzo L.Long-term productive episomal hepatitis B virus replication in primary cultures of adult human hepatocytes infected in vitro.J Virol Hepatol,1996;3:227-238

　　［3］Jens H, Farideh F,Wolfgang S,Peter RG.PH-independent uptake of hepatitis b virus in primary human hepatocytes.Virology,1997;229:292-294

　　［4］Lu X, Block TM,Gerlich WH.Prolease induced infectivity of hepatitis B virus for a human hepatoblastoma cell line.J Virol,1996;70:2277-2285