肺腺癌及肺鳞癌MRP-mRNA的表达及临床意义

　　多药耐药相关蛋白(MRP)是近年发现的一种与肿瘤多药耐药有关的糖蛋白，文献报道MRP表达与肿瘤的分化、分期及预后有关。目前国内尚未见有关肺癌组织MRP的研究。作者检测了30例肺癌组织及肺正常组织MRP的表达情况，报告如下。

　　1　材料和方法

　　1.1　临床资料　30例肺癌标本均为外科肺癌手术患者，每例患者均同时取距癌肿≥3cm的肺组织，手术后立即取材并储存于液氮罐中。30例患者中：男性24例、女性6例。年龄范围：35～68岁，平均年龄55.31岁；其中：鳞癌14例、腺癌16例。根据肿瘤的分级标准［1］，14例鳞癌中：中～高分化者8例，低分化者6例；16例腺癌中：中～高分化者9例，低分化者7例。所有患者术前均未进行任何抗肿瘤治疗。

　　1.2　MRP引物序列

　　5′ACACTCCACAGATCACTC3′

　　5′CATGGTGCAGGGTCTACG3′

　　扩增片段为290bp

　　1.3　步骤

　　1.3.1　总RNA提取　取新鲜组织2～3mg，捣碎后，置样品管中，加入200μl裂解液，充分震荡，使沉淀完全溶解，加入40μl氯仿混匀，12000r/min离心5min，小心吸取上层水相，加3倍体积无水乙醇，-20℃放置20min，12000r/min离心5min，弃上清，室温晾干约20min，即可得到标本的总RNA。

　　1.3.2　RNA-cDNA反转录　向处理好的样品中加入15μl逆转录液、1μl酶混合液，离心数秒，42℃水浴30min。

　　1.3.3　PCR扩增　以MRP阳性模板作为阳性对照，以DEPC水代替cDNA作为阴性对照。取反转录产物、阳性对照及阴性对照各5μl，分别加入20μlPCR液、1μlTaq酶，一滴石蜡油，离心数秒，按下述条件扩增35个循环：

　　94℃45s　　　55℃45s　　　72℃45s

　　1.3.4　电泳鉴定　含EB的2%琼脂糖配制：100mlTBE(Tris-硼酸)+2g琼脂糖+5μlEB

　　用10μlPCR产物、2μl上样缓冲液混匀后点样，恒压5V/cm，电泳时间为溴酚蓝染料走至1/3～1/2胶长处。

　　1.4　结果记录及判断　阳性结果为两条带，分别为：MRP带(290bp)，β2微球蛋白带(430bp)。阴性结果为一条带，为β2微球蛋白带(430bp)。

　　1.5　统计学处理采用校正卡方检验。

　　2　结　果

　　30例肺癌组织中，MRP-mRNA表达阳性者13例，其中：鳞癌3例、腺癌10例；癌旁肺组织中，MRP-mRNA表达阳性者8例，其中：鳞癌2例、腺癌6例(表1)。

表1　肺癌组织及相应癌旁肺组织MRP-mRNA表达(n=30)

　 MRP-mRNA阳性(%) MRP-mRNA阴性(%)
肺癌组织 13(43.3) 17(56.7)
癌旁肺组织 8(26.7) 22(73.3)

　　MRP的表达与临床分期无明显关系(P＝0.511)，与癌细胞的分化程度有关(P＝0.03)。病理类型显示：MRP在腺癌的表达(62.5%)高于鳞癌(21.43%)，P值未见显著性差异可能与例数较少有关(表2)。

表2　不同病理特征患者MRP-mRNA表达
 
病理特征 例数 MRP-mRNA 阳性率(%) P
(+) (-)
病理类型     
鳞　　癌 14 3 11 21.43 
腺　　癌 16 10 6 62.5 　0.058
病理分期     
Ⅰ 1 0 1 0.00 
Ⅱ 20 8 12 40.00 
Ⅲ 8 4 4 50.00 
Ⅳ 1 1 0 100.00 0.511
组织分化 13 9 4 69.23 
低分化     
中高分化 17 4 13 23.53 0.03

　　3　讨　论　　肺癌的耐药性有多种机制，MDR1是近10年来研究较多的一种耐药机制，随着研究的深入，人们发现MDR1的表达不足以解释非小细胞肺癌的多药耐药，而且在一些耐药的肺癌中也未发现P-gp的过度表达。自1992年Cole发现多药耐药相关蛋白(MRP)后，研究MRP与肺癌多药耐药的关系成为人们关注的热点，MRP基因位于16号染色体P13.1带上，由2.8kb碱基组成，该基因编码1531个氨基酸组成的蛋白质，其分子量为190ku碱基组成，该基因编码1531个氨基酸组成的蛋白质，其分子量为190ku，其多药耐药作用与P-gp的表达无关，而与细胞内MRP的药物泵作用及其引起细胞内药物浓度降低有关［2］，MRP的耐药谱与MDR1相仿。国外研究表明：MRP基因的表达与肺癌的分期、分化及预后有关［3～5］，也有研究认为：MRP在肺癌耐药中的作用有可能大于MDR1［6］。笔者检测了肺癌及肺正常组织MRP基因的表达情况结果表明：43.33%的肺癌组织有MRP-mRNA表达，从癌细胞分化程度可以看出：低分化者MRP-mRNA的表达(69.23%)明显高于中高分化者(23.53%，P＜0.05)，说明MRP的表达与细胞分化程度相关。本研究30例患者中，肺腺癌16例，有10例患者表达MRP，占62.5%，这与临床上肺腺癌对化疗不敏感是一致的。本研究的所有患者术前均未行任何化疗，说明MRP的表达为先天性。■

　　作者简介：杨俊兰，女，1964-01-06生，山西省临猗县人，1985年山西医学院毕业，1993年军医进修学院硕士毕业，解放军总医院肿瘤内科副主任医师；发表论文10篇。电话：(010)66937098

　　作者单位：杨俊兰（解放军总医院肿瘤科，北京　100853）

　　　　　石廷章（解放军总医院肿瘤科，北京　100853）

　　　　　魏秀芳（解放军总医院肿瘤科，北京　100853）

　　参考文献：

　　［1］俞孝庭.肿瘤病理学［M］.上海：科学技术出版社，1986.

　　［2］Grant CE, valdimarson G, Hipfner DR et al. Overexpression of multidrug resistance-associated protein (MRP) increases resistance to natural product drugs ［J］. Cancer Res, 1994,54:357-360.

　　［3］Higashiyama M, Doi O, Kodama K et al. Immunohistochemically detected expression of motitity-related protein-1 (MRP-1/CD9) in lung adenocarcinoma and it′s relation to prognosis［J］. Int J Cancer, 1997,74(2):205-210.

　　［4］Ota E, Abe Y, Oshika Y et al. Expression of the multidrug resistance-associated protein (MRP) gene in non-small-cell lung cancer ［J］. br J Cancer, 1995,72(3):550-554.

　　［5］Nooter K, Bosman F T, Burger H, et al. Expression of the multidrug resistance-associated protein (MRP) gene in primary non-small-cell lung cancer［J］. Ann Oncol, 1996,7(1):75-79.

　　［6］Narasaki F, Matsuo I, Ikuno N et al. Multidrug resistance-associated protein (MRP) gene expression in human lung cancer. Anticancer Res ［J］,1996,16(4A):2079-2084.