实验性阿霉素心肌炎心肌肌钙蛋白Ⅰ免疫组化研究

　　【摘要】　心肌肌钙蛋白I(cTnI)是诊断心肌损伤敏感特异的生化指标，已广泛应用于缺血性心肌损伤的诊断，对于终末期心力衰竭中cTnI的改变也做了较为深入研究，但关于心肌炎中cTnI的研究尚很少。目的　应用抗cTnI单克隆抗体对实验性心肌炎进行免疫组化研究，观察其在炎症心肌中的定位分布，初步探讨cTnI在心肌炎评估、诊断中的重要意义，为cTnI应用于心肌炎诊断提供重要实验和理论依据。方法　提取纯化人cTnI，制备抗cTnI单克隆抗体和SD大鼠心肌炎模型，对正常和心肌炎大鼠心肌行HE和SP染色。结果　HE染色：正常大鼠心肌细胞呈梭形，核清蓝色，肌纤维呈深红色，胞浆淡红色。心肌炎大鼠心肌散在局灶病变区，表现为两种不同的变化，一是心肌细胞变性伴不同程度的心肌坏死，二是肌纤维溶解坏死。SP染色：正常心肌细胞不着色。炎症区心肌细胞着色变深呈不均匀细颗粒状。坏死区心肌细胞和肌纤维均不着色，仅余网状细胞骨架呈棕褐色着色。结论　应用cTnI能较好地反映心肌炎症的部位、程度，结合外周血cTnI水平的测定，可能有助于心肌炎的诊断。

An immunohistochemical study with cardiac troponin I in experimental adriamycin myocarditis

Jiao Baoming, Li Zhiliang, Qian Hongjin

　　（The Second Outpatient Department of Guangzhou Army, Guangzhou 510080）

　　【Abstract】　Background　Cardiac troponin Ⅰ(cTnI), as a sensitive and specific biochemical mark of cardiac injuries, has been widely used in diagnosing of myocadial ischemia, recently its alteration in end stage heart failure has also been recognized profoundly, but it was known fewer in myocarditis.Objective This study was designed to determine the inflammatory region and degree in experimental myocarditis by immunohistochemistry, and to assess the test performance characteristics of histionic cardiac troponin Ⅰ (cTnI) for diagnosis of myocarditis. Methods　Balb/c mice were immunized with cTnI. Several high specific monoclonal anti-cTnI antibodies were developed after cell fusion, cloning and screening. The localization and degree of myocardial inflammation were analyzed by HE and SP staining.Results　The 3D2 were selected as the first antibody among the five hydridoma cell lines. After SP staining, the area of inflammatory myocardium displayed as an uneven granular material, the reticulate cell frameworks in the necrosis area were dyed brown, while the normal myocardium were not be stained.Conclusion　The specific monoclonal anti-cTnI antibody could reveal the localization and degree of the inflammation in myocarditis, and could be used as a diagnostic method to myocarditis.

　　【Key words】　Cardiac troponin I Monoclonal antibody Myocarditis Diagnosis Immunohistochemistry

　　心肌肌钙蛋白I(cTnI)是心肌肌钙蛋白复合体的一个亚单位，存在于心肌肌原纤维细肌丝上，参与心肌的兴奋-收缩偶联，是心肌细胞的结构蛋白。有研究表明，cTnI仅存在于心肌，是心肌细胞的独特标志［1］。在心肌损伤诊断中敏感性强、特异性高，较CPK，CK-MB佳［2～5］，现已广泛应用于急性心肌梗死(AMI)、不稳定型心绞痛(UA)、PTCA术后、心律失常射频消融术后、心脏以及非心脏手术后心肌损伤的评估和诊断。本文基于cTnI对心肌损伤的高度特异性、敏感性，用cTnI单克隆抗体对实验性心肌炎进行免疫组化研究，观察其在炎症心肌中的定位分布，初步探讨cTnI在心肌炎评估、诊断中的重要意义，为cTnI应用于心肌炎诊断提供重要实验和理论依据。

　　材料与方法

　　1.材料：苯甲基磺酰胺(PMSF)、DDT，Sigma产品；丙烯酰胺、双异丙烯酰胺，德国Mech产品；福氏不完全佐剂，Sigma产品；羊抗鼠IgG-HRP，北京军事医学科学院产品；SPA，Sigma产品；SP试剂盒，Maxiam产品；固相免疫cTnI定性检测试剂盒，PBM公司产品；动物人工呼吸机，浙江医科大学仪器厂；Olympus显微镜，日本制造；其他化学药品均为国产分析纯试剂。

　　2.方法

　　(1)cTnI的纯化与鉴定：采用李志梁等已建立的cTnI纯化方法［6］。取健康成人意外死亡6小时内的心脏，经匀浆、高盐溶解、无盐沉淀、高温去杂、硫酸铵盐析、DEAE-DE32柱状层析等步骤提取纯化人cTnI，纯化后的cTnI经分子量、紫外吸收光谱、免疫原性和氨基酸组分鉴定。

　　(2)抗cTnI单克隆抗体的制备：取50　μg cTnI加福氏完全佐剂、卡介苗乳化后注入Balb/c小鼠腹腔，此后每周用25　μg cTnI加不完全福氏佐剂注射，连续6次。取脾细胞与Sp/20骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞。间接ELISA法筛选阳性细胞株，经过反复克隆化获得到5株抗cTnI单克隆抗体细胞株，分别为1H9、3D2、1H12、3A7、3A11，以3D2为本实验免疫组化第一抗体。

　　(3)大鼠阿霉素心肌炎模型的制备［7］：体重200～300 g SD大鼠12只，雌雄不限。其中8只给予阿霉素3 mg/kg腹腔注射，隔日1次，共4次，总剂量12 mg/kg；4只腹腔注射生理盐水作为正常对照。两组动物饲养6周，每隔1周尾静脉采血测血清酶及cTnI。

　　3.取材和染色：6周后两组大鼠均经3%戊巴比妥钠麻醉，气管插管人工辅助呼吸，分离腹主动脉行腹主动脉插管，剪开右心耳，生理盐水充分灌注后用多聚甲醛在体灌注固定，取左室心肌进行石蜡包埋，组织切片(5　μm)。两组标本均行HE染色和免疫组化SP染色。HE染色法：经二甲苯及不同浓度的酒精脱水、洗涤、伊红染色及中性胶封闭。免疫组化SP染色：经二甲苯至水脱蜡水化，过氧化物酶阻断，加入抗cTnI单克隆抗体，4℃湿盒过夜，再加生物素标记的羊抗鼠Ig,加链霉亲和素-HRP显色、复染、中性胶封闭。

　　结　　果

　　1.进行实验的12只大鼠均存活至实验终点，经组织学鉴定：对照组心肌完全正常；心肌炎组心肌存在不同程度的变性、坏死及淋巴细胞浸润，符合心肌炎的病理改变。

　　2.心肌炎组大鼠第四周血清心肌酶及cTnI变化：(见下表)

心肌炎大鼠(n=8)第4周血清心肌酶及cTnI改变(单位)

血清酶

　　注前前

　　注射后
 　 LDH 　 GOT 　　CK 　　CKMB cTnI
　43.02±10.63 　16.32±8.01 　176.43±24.31 　18.25±7.93 阴性
600.15±40.35 103.56±30.43 854.19±40.12 594.45±37.83 阳性

　　3.HE染色：正常大鼠心肌细胞呈梭形，核清蓝色，肌纤维呈深红色，胞浆淡红色(见图1)。心肌炎大鼠心肌散在局灶病变区，表现为两种不同的变化，一种是心肌细胞变性伴不同程度的心肌坏死，表现为胞核肿胀，胞浆凝集或溶解消失，横纹结构不存在，炎性细胞浸润；另一种是肌纤维溶解坏死，胞核固缩，胞浆和肌原纤维伊红染色消失，炎细胞浸润(见图2、图3)。

　　4.SP染色：正常心肌细胞不着色(见图4)。炎症区心肌细胞着色呈棕黄色不均匀细颗粒状，肌纤维仅有小部分着色，凝集的胞浆着色稍浓(见图5)。坏死区心肌细胞和肌纤维均不着色，仅余网状细胞骨架呈棕褐色着色(见图6)。

　　讨　　论

　　cTnI具有严格的心肌组织特异性及高度敏感性，在心肌损伤的诊断［2～5］及与其他组织损伤的鉴别中具有重要意义［2，8］。与常规心肌酶及cTnT相比，急性期它们的敏感性相同，但特异性cTnI更高［9］。国内外已有少数关于心肌炎外周血cTnI的研究，提示在心肌炎诊断中cTnI的检测优于cTnT、CKMB，它不仅敏感性高，而且检测时间窗宽［10，11］。本文应用阿霉素心肌炎模型通过免疫组化研究，观察cTnI在不同程度炎症损伤的分布特点，初步探讨炎症损伤与cTnI间的关系，为cTnI在心肌炎诊断中的应用提供重要的实验依据。