低温停循环与神经元凋亡

www.cnkang.com 2007-3-23 16:36:00 中华康网

　　摘要：细胞凋亡(apoptosis)是由许多生理及病理刺激引发的细胞自杀过程，是生物体内普遍存在的不同与坏死(necrosis)的生理性细胞死亡。它是个主动的，按照一定程序进行的细胞死亡。凋亡的形态学特征主要表现为细胞萎缩，细胞器保持完整但紧密压缩，核固缩，染色质凝聚，DNA断裂，细胞形成“凋亡小体”，然后被吞噬。生理性细胞死亡最终途径是凋亡，机体通过凋亡的方式来清除生理上多余或发育上不正常的细胞，维护细胞数量上的稳定和组织器官正常的生理功能。在外界影响和病理情况下，细胞会发生非正常的凋亡。凋亡细胞在琼脂糖电泳可见阶梯状条带，TUNEL法染色可见标记的DNA被染色。

　　与凋亡相比，坏死的特征是细胞被动肿胀，线粒体严重损害，细胞自身稳定被彻底破坏，引起膜溶解和细胞内容物释放。它不需能量，大分子合成或基因转录就能进行。形态学上有细胞肿胀和分解，细胞膜完整性消失和炎性反应。

　　低温停循环最早是用于先天性心脏病手术治疗的一种技术。由于它通过大血管阻断和血液回流至储血瓶内提供了一个无血的手术视野，现在已广泛应用于心脏手术及其他手术中。但在停循环期间提供的是一个缺血缺氧的环境，而中枢神经系统对这种环境十分敏感，所以一般要求低温停循环时间不超过45分钟。若时间延长，并发症与死亡率明显升高。其中神经元凋亡是一个重要的原因。由低温停循环引起的凋亡有时间性，它在低温停循环后8小时达高峰，20小时后开始减弱，72小时后消退。这种凋亡常发生在海马的齿状回，新皮质的第2层，内嗅皮质的第2、3、5层和基底节〔1〕。其中以海马齿状回处的凋亡最明显，也最易定量检测〔2〕。临床上低温停循环的神经系统后遗症包括手足舞蹈徐动症，学习与记忆受损，智力发育受损等。其中手足舞蹈徐动症与基底节病变有关〔３〕，智力发育受损与海马损失有关〔3〕。识别记忆受损与新皮层和内嗅皮质有关〔4〕。现在对低温停循环造成的缺血缺氧所引起的神经元凋亡已日益重视，对其中的机理的研究也不断深入。

　　一、神经元的凋亡因子

　　细胞的凋亡被认为是一个主动过程，是通过合成新的蛋白质而实现的。在中枢神经系统，对神经元凋亡基因研究较多的有Caspase家族和Bcl-2家族。

　　caspase是一种特异性的在天门冬氨酸残基后裂解靶蛋白的保守的半胱氨酸蛋白酶，至今哺乳动物的Caspsse家族已发现至少14种，按发现顺序命名为Caspasel-14,其中大部分介导凋亡。Caspase常以无活性的蛋白酶原procaspase形式在细胞内合成与分泌，其作为特异的死亡信号转导因子，激活后的Caspase被认为是凋亡的执行者。传入细胞的死亡信号将这些前体转化为成熟的有活性的酶，活化后的Caspase又能激活下游的Caspase，形成级联反应，而且在合适的情况下，Caspase还能自身活化，并催化其他procaspase产生活性蛋白酶，发动“瀑布效应”。活化的Caspase作用于各种底物，引起细胞的各种形态学变化，也引起琼脂电泳中特征性的DNA梯状条带。Caspase作用特点是能识别底物解位点NH2末端最少4个氨基酸并在天门冬氨酸后裂解底物，不同的Caspase因所识别的4个氨基酸不同而具有明显的底物特异性而发挥各自不同的生物学功能。

　　enari等发现由Caspase激活后具DNA酶活性的蛋白CAD(caspase-activated dnase)及其抑制物ICAD，正常细胞中二者形成复合物，由凋亡信号激活的Caspase作用于ICAD，使CAD脱离并进入细胞核，发挥DNA酶的作用分解染色体DNA〔5〕。

　　pARP(poly ADP-ribose polymerase)是DNA修复酶。它是Caspase的底物，经Caspase的蛋白酶解后，PARP的功能丧失，不能进行DNA修复〔6〕。动物实验表明，Caspase的抑制剂Z-VAD和Z-DEVD都可以减轻鼠在缺血后所致的脑损伤〔7〕。尤其是脑室、海马、纹状体给予此类抑制剂可显著减少神经元片段化，改善脑水肿及神经功能缺损等损害。

　　bcl-2是一族通道蛋白质，分布于线粒体、内质网和细胞核的外膜上。从功能上将Bcl-2族蛋白分成凋亡诱导因子包括Bax,Bcl-X5,Bad,Bak,Bik以及凋亡抑制因子如Bcl-2,Bcl-X1,mcl-1。

　　bcl-2对正常细胞的功能和代谢无明显影响，但对病理性细胞的凋亡具有一定的抑制作用，该作用可能与预防细胞的非正常死亡有关。Bcl-2有多环节的细胞保护机制。它能抑制细胞膜上脂质过氧化物的形成，从而阻止氧化应激导致的细胞凋亡；它能对线粒体膜通透性进行调节：正常的线粒体跨膜电位是维护ATP能量产生所必须的。当凋亡信号刺激线粒体时，其膜电位下降，膜对离子的通透性发生改变，能量合成障碍，储存钙大量释放，氧化产物堆积，导致细胞死亡。而对凋亡起重要作用的线粒体的通透性受到Bcl-2家庭的调控〔8〕。线粒体外膜层上的Bcl-2过量表达后，可降低由凋亡因子诱导增加的线粒体膜通透性，同时还增加线粒体摄钙作用。Bcl-2还能抑制线粒体释放的细胞色素C。线粒体释出细胞色素C可激活CPP32(Caspase3)的活性，活化的CPP32可剪切PARP及许多细胞蛋白，加速细胞凋亡。Yang等认为，分布在线粒体外膜上的Bcl-2在细胞内过量表达，可预防细胞色表C从线粒体释放，间接抑制Caspase活性，阻止凋亡发生〔9〕。KlucK等认为Bcl-2不是通过改变线粒体膜电位来阻止细胞色素C释放，其机理还需研究〔10〕。Bcl-2能直接阻止细胞色素C外流，也能通过调节线粒体、内质网的跨膜离子流包括钙离子来间接阻止细胞色素C外流。而Bax,Bak则因可协助线粒体释出细胞色素C而促凋亡，Bcl-2和Bcl-Xl可拮抗Bax作用而抑制凋亡。

　　二、NO与神经元凋亡

　　nO是一种具广泛生物学效应的小分子化合物，其在神经元凋亡中的作用也十分重要，当NO介导的正常生理反应受到破坏后，将会对神经元造成伤害，与NO能起反应的包括氧，过渡金属，含硫铁蛋白，含血红素蛋白。NO能与鸟苷酸环化酶血红素部分的铁结合，能改变鸟苷酸环化酶的构型，促进磷酸鸟苷环化生成CGMP，CGMP能活化其他细胞过程并调节脑部血流。NO能与含铁硫蛋白的酶反应，如NADH泛醌氧化还原酶和NADH琥珀氧化还原酶；NO能抑制这二个酶，通过阻止氧化磷酸化而造成神经元受损。NO还能抑制顺乌头酸酶而阻止糖酵解，能竞争抑制细胞色素氧化酶的氧化而抑制线粒体呼吸。NO还能抑制肌酸激酶的活性，阻止磷酸激酶与ATP间的磷酰基转移，导致ATP的减少。缺氧时，NO通过与核苷酸还原酶含酪氨酸自由基的β椦堑ノ唤岷希种泼傅墓δ艽佣榈糄NA损伤。可见，NO本身就能损伤细胞结构和功能。NO发动脱氨基作用造成DNA损伤，又活化多聚ADP核酸合酶，该酶活化后修补受损DNA而耗用ATP，最终使细胞能量供应耗竭〔11〕。

　　nO带不配对电子，是一种自由基气体。它作为反应性很强的物质，可与超氧自由基反应，生成过氧亚硝酸根离子，并进一步生成过氧亚硝酸或降解成羟基自由基及二氧化氮，这些化合物性质活泼，它们可引起蛋白质、核酸及脂质膜的损伤。过氧亚硝酸根离子(ONOO-)能作用于线粒体Mn-SOD，使之活性受损，造成线粒体无法消除O2，从而引发启动一系列自发的级联反应，而且ONOO-能导致脂质过氧化和硫基的氧化，造成神经元损伤。

　　nO的前体是精氨酸，其代谢途径是鸟苷酸循环，主要是通过一氧化氮合酶的作用生成。一氧化氮合酶(NOS)有三种类型：神经元型NOS(nNOS)，内皮细胞型NOS(eNOS)和免疫型NOS(iNOS)。神经元型NOS与内皮细胞型NOS都依赖钙离子或钙调蛋白；免疫型NOS不依赖钙离子或钙调蛋白，会在免疫反应和神经损伤时表达〔11〕。nNOS主要在神经系统的一部分神经元和全身其他一些器官组织内表达。在神经系统产生的NO与介导突触和神经信号有关，同时在缺血损伤时也产生神经毒性。由nNOS产生的NO神经毒性NO的主要来源，而且在脑缺血造成的损伤早期起重要作用。iNOS一般在健康组织中难发现有表达，它常在病理情况下表达，包括在神经元、星形细胞和内皮细胞。eNOS主要在内皮细胞表达，由于NO是血管血流动力学的主要调节因子和介导血管松弛的信息分子，所以由eNOS介导产生的NO可以通过维持局部脑血流起到保护脑组织的作用〔12〕。长时间的低温停循环会带来不可避免的脑损伤，NO在其中有重要的作用。Brock等使用L-［１４C］-精氨酸作为NO生成的指标对狗进行实验，证明低温停循环导致nNOS早期、明显的表达，使脑内NO广泛增多；用细胞免疫化学方法标记NOS特异的单克隆抗体，发现nNOS在低温停循环6至18小时后表达〔13〕。而且NO释放有时间性，随着时间推移，约在低温停循环后3天，NOS的活性渐下降至正常。Tseng等用选择性nNOS阻断剂7-nitroindaxole和17477AR都明显减少由低温停循环所致的NO生成和神经元凋亡，证实了NO介导低温停循环所致的神经元凋亡，并发现NO的产生主要是在恢复循环再灌注时〔1，4〕。Baumgartner等也证明低温停循环导致NO生成增加造成神经元持久伤害，用7-nitroindazole可明显改善低温停循环后狗的特异种属评分(species-specific behavioral scale)〔14〕，证明NO是一个重要的神经毒性物质。

　　三、兴奋性毒性与钙超载

　　由于许多神经损伤因素最科都将通过兴奋性毒性这一最终通路造成神经元变性和死亡，所以对低温停循环对神经元凋亡的影响中兴奋性毒性也日益重视。哺乳动物的中枢神经系统中较常见的兴奋性氨基酸有谷氨酸、天冬氨酸和甘氨酸。谷氨得脑中基本的神经递质，主要分布在大脑皮质、小脑和纹状体，与许多神经生理功能有关，如认知、记忆、运动和感觉。但在病理情况下，细胞外过多的兴奋性氨基酸，包括谷氨酸和天冬氨酸，将活化谷氨酸受体。谷氨酸受体分二类：一类是与G蛋白相关的代谢型受体，另一类是与离子通道有关的离子型受体；离子型受体又分三种类型：NMDA受体、AMDA受体(a-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionate)和KA受体(kainic acid)。活化这些受体将导致细胞膜去极化。NMDA受体过度激活，Ca２＋大量内流造成神经元钙超载，激活与细胞毒性有关的酶，如蛋白激酶C、磷脂酶、蛋白酶、NOS等。磷脂酶A２激活后产生大量花生四烯酸和血小板活化因子。血小板活化因子可提高细胞内Ca２+浓度，刺激谷氨酸释放；花生四烯酸代谢中生成大量氧自由基，氧自由基又导致更多的磷脂酶A２，形成正反馈，导致神经膜降解，DNA断裂〔15〕。NOS使氧与精氨酸生成NO与瓜氨酸，NO与超氧阴离子生成超氧亚硝酸根离子，导致脂质过氧化，DNA变性和神经元死亡。兴奋性毒性物质，主要是谷氨酸，在细胞外浓度增高，是神经元受损的主要因素。由于细胞ATP不足，细胞能量代谢受损，Na＋浓度梯度无法维持，造成谷氨酸转运系统失效，细胞外谷氨酸堆积，而Na+-K＋－ＡＴＰ酶活性下降，进一步导致细胞内Na＋增多，导致神经元除极，突触释出谷氨酸，能量不足，ATP短缺，还可使星形细胞内的谷氨酰胺合成酶无法将谷氨酸转化为谷氨酰胺，使细胞内谷氨酸堆积。这些细胞内外的兴奋毒性物质使神经元受损，从而释出更多谷氨酸加重损伤更多神经元。从受体来说，NMDA受体的离子通道受到电压和配体的双重控制；但在膜电位被破坏的情况下，这二者都受到影响，NMDA受体的活性明显升高，容易受到谷氨酸的激活〔15〕。Tseng等使用微透析技术和高效液相色谱分析定量分析了狗在低温停循环下脑内兴奋性氨基酸的浓度，发现低温停循环后兴奋性氨基酸明显增加，并证明明其增加是由低温停循环引起的〔2〕。Redmond等对在低温停循环的狗停循环前使用选择性NMDA受体阻断剂dizocilpine(MK-801)取得神经保护效果〔3〕。说明了兴奋性氨基酸与NMDA受体的作用。作为离子型通道的NMDA受体能对Ｃa２＋，Ｎa＋和K＋通道，其中Na＋和Ca２+内流与突触传递有关。而NMDA受体介导的K＋外流与神经元凋亡有关。Yu等通过增加细胞外K＋浓度减少K＋外流而减轻神经元凋亡并分离出NMDA受体介导的外向Ｋ＋电流〔16〕。谷氨酸作用使细胞内Ca２＋浓度增高，还通过对Bcl-2家族成员的影响促进神经元凋亡。Wang等发现在海马神经元，Ca２＋增多能活化钙调神经磷酸酶(calcineurin)，该酶能使Bcl-2家族中的促凋亡因子BAD去磷酸化，从而增强BAD与Bcl-2家族中抗凋亡因子Bcl-X1形成杂二聚体并定位于线粒体，增加这种不依赖转录的凋亡作用〔17〕。四、线粒体线粒体是细胞中重要的细胞器，它与ATP的产生，电子的转移，氧化磷酸化，反应性氧的产生，Ca２＋升高都有密切关系。近年来对线粒体在神经元凋亡中的作用也日益重视。通透转运孔(permeability transition pore,PTP)是位于线粒体内外膜交界处的一种由多种蛋白组成的复合体，其中有外膜的电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion channel,VDAC)，内膜的腺嘌呤核苷酸转运体(adenine nucleotide translocator,ANT)和线粒体基质的cyclophilin d。PT孔平时允许不大于15KD的小分子物质通过。PT孔参与调节线粒体基质中Ca２＋，pH值，电荷等，维持线粒体内环境的稳定，保持氧化还原通路通畅。在细胞凋亡过程中，线粒体PT孔开放使线粒体基质与胞浆内离子流动，破坏了线粒全内膜跨膜电位，影响了呼吸链运行〔8〕。更重要的是，在细胞凋亡过程中，线粒体会将许多与凋亡相关的活性物质释放入胞浆，其中包括细胞色素C、凋亡诱导因子(AIF)等。在这些活性物质作用过程中，又与Caspase和Bcl-2家族有关系。细胞色素C是讲电子转运入线粒体内膜的载体，在细胞色素C进入细胞浆后能激活Caspase。各种死亡信号可使线粒体释出细胞色素C，而细胞色素C又与Apaf-1(apoptosis protease activating factors)结合使Apaf-1的构象改变并与procaspase-9结合，形成cyto-c-Apaf-1-procaspase-9“凋亡体”(apoptosome)，从而使procaspase-9活化并激活下游其它caspase,dATP与cyto-c还能引发caspase-9与Apaf-1结合而激活Caspase-3〔18〕。dATP的细胞毒性在于它能启动CPP32的活化从而造成DNA片段化。Liu等人在体外实验中分离并发现细胞色素C是dATP依赖的CPP32活化的必需因子，认为细胞色素C是细胞凋亡的必需因子，线粒体是通过释放细胞色素C来参与细胞凋亡的〔19〕。对细胞色素C如何离开线粒体一直在讨论中。一种认为通透转运孔开放，水与溶质进入线粒体，致使线粒肿胀，外膜破裂，细胞色素C释出，这与VDAC，ANT都有关。另一种认为在线粒体外膜上形成一个较大通道，使变形性不强的细胞色素C通过。Shimizu等通过荧光标记细胞色素C的研究，认为Bax和Bak都不能构成这个较大的通道，并提供证据表明Bcl-Xl，Bax和Bak能与VADC作用。其中Bcl-X1特异性地参与VADC通道开放。他们认为VDAC在Bax，Bak作用下，构型可能会改变产生一个足以让细胞色素C通过的大通道〔20〕。因此，Bcl-X1通过防止细胞色素C的释放达到抑制凋亡的作用。VADC的另一个功能是与ANT一起进行ATP/ADP的交换桝TP移出线粒体，ADP移入线粒体。在细胞凋亡时，这种ATP/ADP的交换减少。但在Bcl-X1过度表达时，ADP/ATP交换随呼吸链恢复而恢复。

　　 凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor,AIF)是线粒体中另一种与凋亡相关的活性物质。它是位于线粒体内膜，分子量50KD的蛋白酶。在凋亡信号刺激下，AIF可转移并积聚在细胞核内，导致DNA片段和染色质聚集〔10〕。Susin等证明AIF在凋亡中起着重要作用。他们把AIF注入细胞浆诱导出许多凋亡征象，包括细胞色素C的释放，线粒体膜电位的消失，染色质沉聚，DNA断裂〔21〕。AIF还可与线粒体释出的一些核酸酶作用于细胞核造成核裂解。

　　线粒体在凋亡过程中的功能与作用在神经元凋亡中起重要作用。其原因是线粒体的移动度较大，它在神经元细胞体、轴索、突触之间宽大的空间中能较好地传导细胞死亡信号。同时，VDAC与细胞色素C和Bcl-2之间的关系也为通过防止线粒体功能丧失治疗凋亡引起的病理变化提供了潜在的治疗目标。

　　针对低温停循环后神经元凋亡的各种相关因素及机理，临床上正在设法改进技术，研制药物，减少由低温停循环带来的脑损害。Bellinger等证实使用低流量灌注可获得比低温停循环满意的脑保护效果〔22〕。在低温停循环的血气管理上，Kurth等的实验表明pH稳态较α稳态能更快更有效地获得较一致的脑部深低温〔23〕，有助于脑保护。McCullough等认为应采用比现行临床上更低的温度，使食管的温度达到10～11℃来达到脑保护作用〔24〕。在药物研制中，Caspase抑制剂Z-VAD，Z-DEVD以及NMDA受体阻断剂dizocilpine都在实验中取得了一定的效果。随着对低温停循环下神经元凋亡机理研究的深入，临床上脑保护的水平会不断提高。

　　参考文献

　　1.Tseng EE,et al;Ann Thorac Surg,1997,64:1639-47

　　2.Tseng EE,et al;Ann Thorac Surg,1999,67:771-6

　　3.Redmond JM,et al;J Thorac Cardiovasc Surg,1994;107:776-87

　　4.Tseng EE,et al;Ann Thorac Surg,1999;67:65-71.

　　5.Enari M,et al;Nature,1998;391:43-50.

　　6.Nicholson DW,et al;Nature,1995;376:37-43.

　　7.Li H,et al;Stroke,2000;31:176.

　　8.Green DR,et al;Science,1998;281:1309-1312.

　　9.Yang J,et al;Science,1997;275:1129=1132.

　　10.Kluck RM,et al;Science,1997;275:1132-1136.

　　11.Zhang J,et al;Science,1994;263:687-689.

　　12.Samdani AF,et al;Stroke,1997;28:1283-1288.

　　13.Brock MV,et al,Ann Thoracic Surg;1996;62:1313-20.

　　14.Baumgarter NA,et al;Ann Thorac Surg;1997;67:1871-3.

　　15.Lipton SA,et al;N Engl J Med,1994;330:613-22.

　　16.Yu SP,et al;Science,1999,284:339-343.

　　17.Wang HG,et al;Science,1999,284:336-339.

　　18.Li P,et al;Cell,1997;91:479.

　　19.Liu XS,et al;Cell,1996,86:147-157.

　　20.Shimizu S,et al;Nature,1999,399:483.

　　21.Susin SA,et al;Nature,1999,397:441.

　　22.Bellinger DC,et al;N Engl J Med;1995;332:549-55.

　　23.Kurth CD,et al;Circulation,1997;96 ［suppl Ⅱ］:Ⅱ 358-363.

　　24.McCullough JN,et al;Ann Thouac Surg,1999,67:1895-1899.