中国汉族人群14号染色体上五个STR的遗传多态分析

　　 　　【摘要】　目的　分析中国汉族人群14号染色体上5个STR的基因及基因型分布情况。方法　采用PCR扩增技术和聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，对50名中国汉族人14号染色体上D14S742、D14S306、D14S606、D14S617和D14S611位点的遗传多态性进行分析。结果　在D14S742位点，共观察到5个等位片段和13种基因型，最常见的等位片段为407 bp片段，频率为0.31；D14S306位点，共观察到5个等位片段和13种基因型，最常见的等位片段为198 bp片段，频率为0.31；在D14S606位点，共观察到6个等位片段和13种基因型，最常见的等位片段为247 bp片段，频率为0.47；在D14S617位点，共观察到9个等位片段和21种基因型，最常见的等位片段为145 bp片段，频率为0.35；在D14S611位点，共观察到6个等位片段和13种基因型，最常见的等位片段为155 bp片段，频率为0.29。结论　上述5个多态位点在中国汉族人群中有较好的多态性，其基因频率分布符合Hardy-Weinberg平衡。

Genetic polymorphism of 5 STR loci on chromosome 14 in Chinese Han*

GUO Chenhong　GONG Yaoqin　CHEN Bingxi　LU Yong　WEI Nong　ZOU Yaqun　LIU Xiaojun.

　　(Department of Medical Genetics, Shandong Medical University, Jinan,Shandong, 250012 P.R.China. E-mail:chenhongguo@mailcity.com)

　　【Abstract】　Objective　To understand the distribution of genes and genotypes of 5 STR loci on chromosome 14 in Chinese Han. Methods　PCR and polyacrylamide gel electrophoresis were used to analyze the polymorphism of 5 STR loci (D14S742, D14S306,D14S606, D14S617,D14S611) on chromosome 14 in Chinese Han. Results　5 alleles and 13 genotypes,5 alleles and 13 genotypes, 6 alleles and 13 genotypes,9 alleles and 21 genotypes, and 6 alleles and 13 genotypes were observed at D14S742, D14S306, D14S606, D14S617 and D14S611,respectively.The frequencies of the most common allele at these five loci were 0.31,0.31, 0.47, 0.35 and 0.29 respectively. Conclusion　These five loci are highly polymorphic in Chinese Han and their allele distribution is in good agreement with Hardy-Weinberg equilibrium.

　　【Key words】　short tandem repeat;　genetic polymorphism;　Hardy-Weinberg equilibrium

　　多态位点是进行疾病基因连锁分析、遗传病间接诊断、个体识别等分析的重要工具。在多态位点的选择方面，人们经历了从致病基因、ABO血型系统、HLA位点、限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)、短串联重复序列(short tandem repeat, STR)的发展过程［1］。STR以其在基因组中的广泛分布、高度多态性和简便的检测手段而成为首选的多态位点［2，3］。由于各多态位点的遗传参数(如等位基因数、杂合度等)依群体而异，目前大多数多态位点的遗传参数来自白种人群，不适用于中国人群。为此，我们对中国汉族人群14号染色体上的5个STR位点进行了遗传多态分析，为多态位点在中国人群中的应用奠定基础。

　　1　材料与方法

　　1.1　样本来源　在山东医科大学学生中随机选取无血缘关系的男女学生各25名，抽取外周静脉血2 ml，ACD防凝备用。

　　1.2　方法

　　1.2.1　外周血细胞DNA提取　用美国Puregene公司生产的外周血基因组DNA提取试剂盒提取DNA，经定量后稀释到20 ng/μl的浓度备用。

　　1.2.2　多态标记位点及引物　我们所选择的5个STR位点来源于美国人类连锁合作中心(TheCooperative Human Linkage Center, CHLC)筛选收集的人类基因组扫查引物组6A(human screening set, version 6a)，这五个STR位点均为4核苷酸重复序列，它们在14号染色体上的位置从短臂到长臂依次为：D14S742、D14S306、D14S606、D14S617和D14S611(www:chlc.org)。用来扩增这五个多态标记位点的引物购自美国Research Genetics公司。

　　1.2.3　PCR扩增　扩增体系为25 μl，内含基因组DNA 40～50 ng，1×PCR缓冲液，0.2 μmol/L的每种引物，200 μmol/L的各种dNTP和0.5U Taq DNA聚合酶。扩增条件为：94℃预变性4 min，然后进行35个循环(94℃ 40 s，55～60℃ 40 s，72℃ 50 s)，最后一次循环在72℃延伸7 min。反应完成后取10 μl反应产物在2%的琼脂糖凝胶上电泳，检查扩增情况。

　　1.2.4　聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染　取5 μl反应产物，加入等体积的变性缓冲液(95%的甲酰胺，0.025 kg/L溴酚蓝，0.025 kg/L二甲苯青，10 mmol/L EDTA)混匀，95℃变性5 min后迅速置冰浴上，上样于预电泳20 min的6%变性聚丙烯酰胺凝胶上，恒功率60W电泳2.5～3 h，然后按本室常规方法进行银染［4］。

　　1.2.5　片段大小确定及基因型分析　以6种已知大小的PCR产物混合物(分别为177 bp、181 bp、231 bp、248 bp、344 bp和451 bp)和pUC19 DNA/MspⅠ片段为参照，用直线回归法确定各等位片段大小。将样本中各位点等位片段按大小依次编号为1～9，记录各个体的基因型。

　　1.2.6　数据统计分析　采用直接计数法计算各基因位点等位片段频率和基因型频率，按Hardy-Weinberg定律计算各位点的预期基因型频率和预期杂合度，采用χ2检验进行Hardy-Weinberg平衡吻合性检验。

　　2　结果

　　在50名无血缘关系的汉族人中，D14S742、D14S306、D14S606、D14S617和D14S611位点分别观察到5、5、6、9和6共5个等位片段，各位点最常见的等位片段依次为：等位片段4(407 bp，频率为0.31)、等位片段2(198 bp，频率为0.31)、等位片段3(274 bp，频率为0.47)、等位片段2(145 bp，频率为0.35)和等位片段2(155 bp，频率为0.29)，见表1。

表1　14号染色体上5个多态标记位点等位基因频率

　　Table 1　Allele frequencies of 5 polymorphic loci on chromosome 14

Allele 　　(等位基因)	D14S742		D14S306		D14S606		D14S617		D14S611
	Size(bp) 　　(大小)(bp)	Frequency 　　(频率)	Size (bp) 　　(大小)(bp)	Frequency 　　(频率)	Size (bp) 　　(大小)(bp)	Frequency 　　(频率)	Size (bp) 　　(大小)(bp)	Frequency 　　(频率)	Size (bp) 　　(大小)(bp)	Frequency 　　(频率)
1	395	0.10	194	0.21	266	0.06	141	0.01	151	0.03
2	399	0.23	198	0.31	270	0.13	145	0.35	155	0.29
3	403	0.30	202	0.14	274	0.47	149	0.06	159	0.24
4	407	0.31	206	0.25	278	0.28	153	0.12	163	0.27
5	411	0.06	210	0.09	282	0.05	157	0.01	167	0.15
6					286	0.01	161	0.11	171	0.02
7							165	0.20
8							169	0.11
9							171	0.03
Total(合计)		1.00		1.00		1.00		1.00		1.00

　　各位点的基因型分布见表2。由表2可见，5个位点各种基因型个体数的观察值和期望值无显著性差异，符合Hardy-Weinberg平衡。

表2　汉族人群14号染色体上5个多态位点基因型分布

　　Table 2　Genotype distribution of 5 polymorphic loci on chromosome 14

Genotypes 　　(基因型)	D14S742		D14S306		D14S606		D14S617		D14S611
	Obs 　　(观察值)	Exp 　　(期望值)	Obs 　　(观察值)	Exp 　　(期望值)	Obs 　　(观察值)	Exp 　　(期望值)	Obs 　　(观察值)	Exp 　　(期望值)	Obs 　　(观察值)	Exp 　　(期望值)
1-1	1	0.50	4	2.21	0	0.18	0	0.01	0	0.05
1-2	1	2.30	3	6.51	1	0.78	0	0.35	1	0.87
1-3	3	3.00	3	2.94	2	2.82	0	0.06	1	0.72
1-4	4	3.10	6	5.25	2	1.68	0	0.12	0	0.81
1-5	0	0.60	1	1.89	1	0.30	0	0.01	1	0.45
1-6					0	0.06	1	0.11	0	0.06
1-7							0	0.20
1-8							0	0.11
1-9							0	0.03
2-2	3	2.65	6	4.81	2	0.85	6	6.13	4	4.21
2-3	8	6.90	3	4.34	4	6.11	3	2.10	8	6.96
2-4	6	7.13	9	7.75	3	3.64	3	4.20	7	7.83
2-5	2	1.38	4	2.79	1	0.65	1	0.35	5	4.35
2-6					0	0.13	3	3.85	0	0.58
2-7							8	7.00
2-8							4	3.85
2-9							1	1.05
3-3	1	4.50	3	0.98	13	11.05	0	0.18	4	2.88
3-4	14	9.30	2	3.50	11	13.16	0	0.72	7	6.48
3-5	3	1.80	0	1.26	3	2.35	0	0.06	0	3.60
3-6					1	0.47	2	0.66	0	0.48
3-7							1	1.20
3-8							0	0.66
3-9							0	0.18
4-4	3	4.81	2	3.13	6	3.92	1	0.72	2	3.65
4-5	1	1.86	4	2.25	0	1.40	0	0.12	8	4.05
4-6					0	0.28	2	1.32	1	0.54
4-7							1	2.40
4-8							4	1.32
4-9							0	0.36
5-5	0	0.18	0	0.41	0	0.13	0	0.01	0	1.13
5-6					0	0.05	0	0.11	1	0.30
5-7							0	0.20
5-8							0	0.11
5-9							0	0.03
6-6					0	0.01	1	0.61	0	0.02
6-7							0	2.20
6-8							0	1.21
6-9							1	0.33
7-7							4	2.00
7-8							1	2.20
7-9							1	1.50
8-8							1	0.61
8-9							0	0.33
9-9							0	0.05
Total 　　(合计)	50	50.00	50	50.00	50	50.00	50	50.00	50	50.00
	χ2(9)＝9.93		χ2(9)＝13.55		χ2(8)＝9.42		χ2(11)＝31.05		χ2(8)＝14.98
	χ2(3)＝5.23*		χ2(4)＝2.98*		χ2(1)＝2.91*		χ2(1)＝1.04*		χ2(3)＝2.86*

　　Obs:observed; Exp:expected；*：合并χ2　　根据各位点观察到的等位片段数，可以计算出各位点的预期杂合度，见表3。各位点的预期杂合度与观察到的杂合度无显著性差异。

　　3　讨论

　　疾病相关基因的定位与克隆是人类基因组计划的重要组成部分，基因组扫描是目前定位疾病基因最常用的方法［5］。筛选高杂合度及高信息含量的STR对于疾病基因的连锁分析，构建遗传图有十分重要的应用价值。

　　根据McKusick等［6］及NIH(www.ncbi.nlm.nih.gov)的资料，目前已定位于14号染色体上的疾病有15种，其中10种定位于14q31和14q32上，我们所选的这五个位点中的D14S617、D14S606和D14S611均位于这个区域；D14S306位于14q12(该区域为肥大性心肌病的定位区域)；D14S742位于14q11.2(该区 域为T细胞白血病/淋巴瘤的定位区域)。因此，研究这五个位点在中国汉族人群的多态性分布，对进一步研究这些位点与有关疾病的关系有重要意义。这五个多态位点，在白种人群中有较高的杂合度，在我们所观察的中国汉族人群中，D14S742和D14S306均检测到5个等位片段，D14S606和D14S611检测到6个等位片段，D14S617检测到9个等位片段，它们的杂合度都高于0.65，说明这五个多态位点在中国汉族人群中也有较好的多态性，这对连锁分析、基因诊断和个体鉴别等都有很重要意义。

表3　14号染色体上5个多态位点的杂合度

　　Table 3　Heterozygosities of 5 polymorphic loci onchromosome 14

Loci 　　(位点)	Het.Exp. 　　(预期杂合度)	Het.Obs. 　　(观察杂合度)	χ2 　　(卡方值)	P value 　　(P值)
D14S617	0.7936	0.74	0.4017	＞0.05
D14S606	0.6774	0.58	1.5811	＞0.05
D14S306	0.7692	0.70	0.6140	＞0.05
D14S611	0.7612	0.80	0.2198	＞0.05
D14S742	0.7472	0.84	1.3144	＞0.05

　　Het.Exp:heterozygosity expected；Het.Obs:heterozygosity observed　　多态位点的等位片段分布因群体而异。D14S742位点在白种人群和中国汉族人群中最常见等位片段分别为403 bp和407 bp，最罕见的等位片段分别为395 bp和411 bp；D14S306位点在白种人群和中国汉族人群中最常见等位片段均为198 bp，但最罕见的等位片段在这两个群体中分别为190 bp和210 bp；D14S606位点的274 bp片段在两个群体中都是最常见的等位片段，但该位点在白种人群中只观察到4个等位片段；对于D14S617位点，中国汉族人群中最罕见的等位片段141 bp在白种人群中最常见。这些资料对于研究不同种族的DNA片段多态性和连锁分析，尤其是分析连锁不平衡有重要意义。

　　基金项目：国家自然科学基金(39870409)

　　参考文献

　　［1］Li WD, Wu M. Two different strategies for cloning human disease-related genes. Chin J Med Genet,1996,13(2):99-103.〔李卫东，吴旻.人类疾病基因克隆的两种不同策略.中华医学遗传学杂志，1996，13(2)∶99-103.〕

　　［2］Sprecher CJ, Puers C, Lins AM, et al.General approach to analysis of polymorphic short tandem repeat loci. Bio Techniques, 1996,2092∶266-271.

　　［3］Weber JL, May PE. Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using the polymerase chain reaction. Am J Hum Genet,1989,44(3)∶388-396.

　　［4］Dou XW, Guo CH, Chen BX, et al.Polymorphism analysis of 4 loci of X-chromosome in a Chinese population of the Han nationality. Chin J Med Genet,1998,15(2)∶92-94.〔窦效伟，郭辰虹，陈丙玺，等.中国一个汉族人群X染色体四个位点的多态性分析.中华医学遗传学杂志，1998，15(2)∶92-94.〕

　　［5］Kuang SQ, Zhang YZ, Chen Z. A powerful tool for genome scaning and gene mapping of inherited disease. Chin J Med Genet, 1997,14(2)∶99-103.〔况少青，张宇舟，陈竺.基因组扫描——遗传病相关基因定位的有力工具.中华医学遗传学杂志，1997，14(2)∶99-103.〕

　　［6］McKusick VA, Amberger JS. The morbid anatomy of the human genome:chromosomal location of mutations causing disease. J Med Genet, 1993,30∶1-26