连接蛋白基因Cx26的一个可能的新启动区

　　【摘要】　目的　探讨人类连接蛋白基因26(connexin 26,Cx26)的调控机理。方法　对Cx26基因转译起始点上游的一个DNase-1超敏区片段1.6kb进行序列分析和CAT报告基因分析。结果　Cx26-1.6kb片段具有启动子功能。结论　Cx26-1.6kb中含有2个GT盒(分别位于-6158bp和-6213bp)，1个TTAAAA盒位于-6237bp，这是在人类Cx26基因中新发现的第2个启动区。

A new potential promoter region of the human connexin 26 gene*

PENG Bailu　ZHANG Xun　ZHOU Ming　ZENG Zhaoyang　LI Guiyuan

　　(Cancer Research Institute,Hunan Medical University, Changsha,Hunan, 410078 P.R. China. E-mail: Ligy@public.cs.hn.cn)

　　【Abstract】　Objective　To explain regulatory mechanism of the human connexin 26(Cx26) gene. Methods　A DNase-1 hypersensitive 1.6kb fragment upstream of the 5′-terminus of the Cx26 gene was sequenced and assayed with CAT reporter system. Results　The Cx26-1.6kb sequence serves as a powerful promoter.Conclusion　The Cx26-1.6kb fragment contains two GT boxes (centering at -6158 and -6213 bp), and a TATA-less TTAAAA box (-6237/-6232 bp)which is another promoter region of the human Cx26.

　　【Key words】　Cx26 gene promoter;　sequencing;　CAT reporter assay

　　连接蛋白基因(connexin gene,Cx gene)是细胞间隙连接蛋白基因。Cx基因是一个多基因家庭，不同的连接蛋白由位于不同染色体上的Cx基因编码［1］。在乳腺内腔上皮细胞中，主要表达的Cx基因是Cx26［2］。用递减杂交技术发现Cx26只在正常乳腺上皮细胞系中表达［3］，而在恶性细胞系中不表达，用原位杂交技术对人类乳腺组织进行研究也证实在癌细胞中Cx26的表达下降［4］。将Cx26基因转染到癌细胞中，则抑制其生长，并恢复其分化潜能［5］。所以，Cx26已被看作抑瘤基因的候选者。

　　尽管Cx26基因在乳腺发育过程中可能起关键的生理和病理作用，但只有其编码区(外显子2)在小鼠、大鼠 和人类中得到深入研究［6］，对人类乳腺癌中Cx26基因调控的研究由于缺乏其全长序列而受到制约，为此李桂源等［7］克隆了人类Cx26基因gDNA序列，并对ATG起始点上游-4800bp进行了序列测定和功能研究，绘制出了人类Cx26基因的图谱。

　　我们利用在克隆的人类Cx26基因全长gDNA材料，对Cx26基因ATG起始点上游-4800bp之前的一个1.6kb的DNase-1超敏区片段进行研究，期望进一步阐明人类Cx26基因的调控机理。

　　1　材料与方法

　　1.1　材料　乳腺癌细胞株MDA-MB-134从美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection,Rockville,MD)获得。DNA限制性内切酶和修饰酶购自Promega公司，脂质体转染剂Lipofectamine为Gibco/BRL产品，乙酰-CoA购自Sigma公司，14C-氯霉素购自杜邦公司(Dupont,NEN,美国)。

　　1.2　方法

　　1.2.1　质粒DNA的纯化与序列测定　人类Cx26基因转译起始位点上游-6.4kb～-4.8kb的1.6kb序列已克隆在pGEM-4Z质粒载体中。质粒经扩增，用碱裂解法抽提DNA后经PEG8000纯化，溶于适量TE中。测定吸光度A260(旧称光密度OD)以确定其浓度，经琼脂糖凝胶电泳确定其纯度。样品在全自动测序仪(全自动荧光测序仪377型，美国PE公司)上测序。在联网Internet中运用Basic blast程序与目前所有已知的核苷酸序列进行同源匹配，以确定所测序列是否为新序列。

　　1.2.2　pCAT vector-Cx26-1.6kb重组体的构建　将Cx26-1.6kb分别与pCAT enhancer vector和pCAT promoter vector重组，以分别观察其启动功能和增强功能。 采用平端连接，则可构建插入片段具有不同插入方向的重组体。用来自pGEM-4Z亚克隆的Cx26-1.6kb片段，分别平端连接、重组到pCAT enhancer vector和pCAT promoter vector的多克隆位点处的XbaⅠ位点中。转化后挑选单菌落扩增，用DNA限切酶鉴定阳性转化子及重组体类型。

　　1.2.3　脂质体介导重组体DNA转染哺乳细胞　10 cm平皿中培养的MDA-MB-134乳腺癌细胞达80%汇合时用于脂质体介导的重组体DNA转染。在少量无血清培养基中混合重组体DNA和脂质体以形成DNA-脂质体复合物。细胞经洗涤后加入DNA-脂质体复合物。37℃培养数小时后，洗去DNA-脂质体复合物，换上新鲜完全培养基，继续培养至收获。

　　1.2.4　CAT报告基因分析　经重组体DNA转染的MDA-MB-134乳腺癌细胞培养48 h后离心收获细胞，细胞悬浮在少量0.25mol/L Tris·Cl pH7.5中，经历3次冻融循环后，离心沉淀，取上清，获得细胞抽提物。细胞抽提物经65℃加热10 min以失活内源乙酰辅酶A。在反应管中加入14C-氯霉素，acetyl-CoA，转染细胞抽提物及缓冲溶液以建立CAT反应系统。37℃温育约2 h后，用乙酸乙酯抽提乙酰化氯霉素，真空抽干后溶于少量乙酸乙酯中，各样品点样在硅胶薄层层析板距底缘2 cm高处，晾干后在氯仿∶甲醇(95∶5)中层析约1 h。层析板晾干后放射自显影3 d。

　　2　结果

　　Cx26基因5′-端上游1.6kb克隆于pGEM-4Z EcoRⅠ/Pst Ⅰ位点上。质粒DNA经纯化后，经全自动荧光测序仪测定，其DNA核苷酸序列见图1。将图1中的Cx26-1.6kb序列在联网Internet中运用Basic blast程序与目前所有已知的核苷酸序列进行同源匹配，得到最大Score值为42，最小P(N)为0.26，按两序列间Score值＞200，P(N)＜0.05为有意义同源性比较，则Cx26-1.6 kb为一新序列，此序列在Genbank中的登录号为AF091526。

　　载体pCAT promoter vector和pCAT enhancer vector用Xba Ⅰ线性化并进行去磷酸化反应，从亚克隆中酶切、电泳回收Cx26-1.6kb片段后，均用Klenow大片段补齐粘末端。Cx26-1.6kb分别与pCAT promoter vector和pCAT enhancer vector连接，经转化、筛选，获得按正方向插入的pCAT promoter-Cx1.6 kb重组体(PF)，按反方向插入的pCAT promoter-Cx1.6 kb(PR),按正方向插入的pCAT enhancer-Cx1.6 kb重组体(EF)，和按反方向插入的 pCAT enhancer -Cx1.6kb (ER)。这四种重组体的限切酶鉴定见图2。各重组体DNA经脂质体介导转染到MDA-MB-134乳腺癌细胞株中，经培养、收获细胞后，进行CAT反应。CAT反应产物通过薄层层板(图3)。如图3所示，ER转染抽提物具有强烈的CAT活性，说明Cx26-1.6 kb具有强烈的启动子功能。ER作为Cx26-1.6kb在pCAT enhancer vector中反向插入的重组体而表现出要求正向顺序才具有的启动功能，说明Cx26-1.6 kb原本是反向亚克隆在pGEM-4Z载体中的。而与此插入方向相反者EF的CAT活性小得多，此1.6kb片段也没有表现出增强子功能。据此，图1中的DNA序列即是按功能方向排列的。

图1　人类Cx26基因ATG转译起始点远端上游1.6kb的DNA序列(A)和人类Cx26基因的结构简图(B)　有下划线部分为TATA-less TTAAAA box和GT boxes

　　Fig 1　1.6 kb DNA sequence located 5′upstream of ATG translation start site of the human Cx26 gene(A) and map of the human Cx26 gene(B)　The sequence of TATA-less TTAAAA box and GT boxes are underlined

图2　pCAT vector-Cx1.6重组体的鉴定　1：PF/XbaⅠ+PstⅠ；2：PR/XbaⅠ+PstⅠ；3:EF/XbaⅠ+PstⅠ；4：ER/XbaⅠ+PstⅠ;5:λDNA/HindⅢ+pGEM 7Zf(+)/HaeⅢ markers

　　Fig 2 Identification of pCAT vector-Cx1.6 recombinants 1:PF/XbaⅠ+PstⅠ;2:PR/XbaⅠ+PstⅠ;3:EF/XbaⅠ+PstⅠ;4:ER/XbaⅠ+PstⅠ;5:λDNA/HindⅢ+pGEM 7Zf(+)/HaeⅢ markers