肝纤维化和肝硬变基因治疗的研究现状

　　肝硬变是慢性肝病晚期的组织学改变，表现为肝实质细胞广泛破坏和再生，纤维结缔组织大量增生造成肝小叶和血管结构的无序化，结果常引起肝功能失代偿、食管静脉曲张、腹水和肝癌等致死性并发症．长期以来，对肝纤维化和肝硬变缺乏有效的治疗方法．近年来随着分子生物学的发展，初步阐明了肝硬变发病机制，从而在基因水平上治疗肝纤维化的研究取得重大进展[1-3].现综述如下．1肝硬变的发病机制引起人体肝硬变的原因很多、涉及的发病机制复杂[3-5]．在实验中通常应用四氯化碳(CCl4)或二甲基亚硝胺(DMN)诱导的大鼠肝硬变模型研究相关的发病机制，因为其特点与人肝纤维化和肝硬变的病理相似：肝脏实质细胞塌陷，形成了由纤维间隔分离开的再生结节，网硬纤维(reticulinfibers)呈放射状分布于整个肝脏。如果不及时进行治疗，通常大鼠7wk内死于广泛性肝纤维化和肝功能失代偿[1,6].虽然肝硬变的分子机制尚未完全弄清，但是已证实DMN诱导肝细胞脂肪的降解，贮脂细胞(Ito细胞)的激活和增生，Kupffer细胞的浸润和TGF-β的分泌．现认为肝窦周间隙的星状细胞(又叫做Ito细胞、贮存细胞)在肝纤维化过程中起主要作用，在肝损伤和伤，愈合的过程中，它经历了显著的形态学和功能上的变化，后者又称为“激活”，产生应激纤维和大量的细胞外基质(ECM)．尤其是在DMN诱导肝损伤过程中大量产生TGF-β1，后者是一种致纤维化的细胞因子，它主要是刺激肝星状细胞合成ECM，此外TGF-β1还与另外一些细胞因子(血小板衍生生长因子PDGF)、小分子的多肽等一起在纤维化的进展中发挥关键的作用[5-7]．有关作用机制不仅涉及到TG-β1诱导肝星状细胞向肌纤维样母细胞转化，后者促进了细胞外基质成分的产生，减少了细胞外基质蛋白的降解，而且TGF-β1、还能较强的抑制表皮细胞、内皮细胞(包括肝细胞)的生长，特别是TGF-β1诱导肝细胞的程序性死亡(凋亡)．在TGF-β1转基因小鼠中，同样证实高水平的TGF-β1，表达，使小鼠易发生肝纤维化．由此可以设想：凡具有影响星状细胞的激活和抗TGF-β1生物学活性药物，就有可能阻止肝纤维化进程，同时有利于肝细胞的再生、阻止肝细胞凋亡和损伤，对肝纤维化具有治疗和预防作用[1，6-8]．由于ECM还可能和整合素(integrin)相互作用，从而影响有关细胞的结构、功能，诱导基因表达、刺激细胞的增殖．此外，蝶氏(Disse)间隙的纤维化(如胶原纤维和纤雏结合素的聚积)可能阻断了肝窦状间隙和肝细胞之间的分子交换，同时捐害了肝细胞的功能，所以减轻Disse间隙的纤维化更有效的改善肝功能．即使在肝硬变晚期减轻的肝纤维化可能缓解肝脏的损害，所以有助于减轻肝功能失代偿的程度[9]。2基因治疗的方案2．1阻断TGF-β信号传导的治疗方案由于TGF-β是一种重要的细胞因子，它参与细胞外基质(ECM)蛋白质的产生、降解和聚集的一系列过程，因而与纤雏增生有重要关系[7，10，11]．通过研究抗TGF-β作用将会有效地阻断纤维化的过程，为此，Qietal首先重组了腺病毒载体AdCATβ-TR，目的是表达截断的人Ⅱ型TGF-β受体，阻断丁TGF-β信号传导,他们应用AdCATβ-TR(109pfu／Ml)从门静脉一次性输入的，再用DMN诱导肝脏纤雏化的模型．3d后，应用Northern杂交检测发现大鼠肝脏中截短的人TGF-β受体表达水平大约是对照组(经过生理盐水和AdCALacZ治疗)的20倍．通过免疫组化检测显示在AdCVTβ-TR治疗的大鼠肝组织中，I型胶原、纤维结合素(fibronectin)，a-SMN,TGF-β等表达均受到抑制．通常血清透明质酸的水产是反映患者肝纤维化进展的指标。经过AdCATβ-TR治疗的大鼠，血清透明质酸水平低，而且血清ALT水平也降低了60倍．而对照组血清透明质酸水平却很高，而且在3wk内均死于肝纤维化和肝功能衰竭．所以本实验的重要发现在于，在抗TGF-β信号传递过程中，终止了肝纤维化的进程、同时伴随着肝功能改善、体重损失缓解和存活时间延长。由此可见Qietal应用腺病毒载体介导的基因转移阻断TGF-β的信号传递，阻断了纤维化过程能保护肝功能，并具有治疗效果，可见TGF-β的确在体内纤维化过程中起着关键的作用[7]．因而可能是一种有效的、具有应用前景的治疗方案[1，8]．2.2应用HGF基因治疗方案由于肝细胞生长因子(HGF)在肝脏的发育和再生过程中起到不可缺少的作用，还具有抗肝细胞凋亡、激活广泛细胞的有序分裂等活性，因此应用HGF基因转移治疗肝硬变、刺激肝再生也可能是合理的选择，为此Fujimotoetal应用直接转移基因HGF基因到骨骼肌细胞的方法对大鼠肝硬变实施新的基因治疗[2，6，12，13]。他们建立了一种安全、简单、重复性转导HGF基因进入体内骨骼肌的步骤，在DMN诱导的大鼠肝纤维化的wk4，应用肌肉注射HGF-HVJ脂质体进行HGF转基因治疗后，大鼠血浆中人HGF和内源性的鼠HGF大量上升，推测是人HGF基因转移提高了大鼠的HGF的表达水平，C-Met基因编码的HGF受体是酪氨酸激酶蛋白(HGFR)．其中的β链跨膜分布，含有胞质内酪氨酸激酶的功能区，在正常大鼠中，HGFR表达水平很低，在HGF-HVJ脂质体治疗的大鼠中，HGFR受体水平大量上升，并维持在较高水平．HGF的生物活性是通过HGFR的酪氨酸残基磷酸化实现的。给大鼠连续的注射HGF-HVJ脂质体以后，其肝脏中产生很强的HGFR酪氨酸磷酸化．上述结果表明：人HGF的基因转移治疗诱导了人HGF和内源性大鼠HGF的高水平表达，也在很大程度上激活了肝硬变大鼠肝脏中HGF受体．值得重视的是在治疗组，给每只大鼠转染40μg的HGFDNA，可以完全缓解肝硬变，使大鼠免于死亡．在肝硬变的大鼠肝脏中，HGF刺激肝细胞有丝分裂，后者在肝脏再生的过程中起到重要作用．经过HGF基因治疗后，TGF-β1的表达受到强烈地抑制，其结果肝脏中肝星状细胞向肌纤维样母细胞转化受阻，此外，胶原酶的活性增强，因而能观察到肝硬变的Gilsson's鞘和假小叶中纤维结蹄组织的增生也被抑制．组织学观察表明门静脉周围和肝小叶中心的广泛纤维化过程几乎完全终止，肝小叶和血管的结构得到了很好的重建，门脉高压也得到显著改善，可见基因治疗的结果阻断了纤维化进程，刺激了肝再生，重建了肝内结构，所有这些都是评价肝硬变治疗的关键指标．应用TUNEL原位免疫组化测定发现在门脉周围和肝小叶中心部位的纤维化减少，肝腺泡的变形减轻．应用影象分析技术定量检测，发现肝脏纤维化减少70％．更重要的是HGF基因治疗阻断了DMN诱导的肝细胞的凋亡．值得注意的是所有对照组大鼠在DMN处理后的45d内，均死于进行性肝硬变．经证实HGF基因的转导抑制了DMN诱导的TGF-β1的表达，所以，HGF基因治疗疗效的一部分是通过抑制TGFβ1来改善肝纤维化的病变．不过目前还不清楚HGF通过何种确切机制来抑制TGF-β1的表达和功能．在肝硬变的组织中，由肝星状细胞转化的肌纤雏样细胞能特性表达a平滑肌肌动蛋白(a-SMA)，后者与TGF-β1，的表达有高度相关性．尤其是经过HGF基因治疗后，表达a-SMA的阳性细胞也大量地减少．Fijimoto研究了HGF对体外培养的非实质肝细胞的影响，发现在体外条件下HGF能抑制TGF-β1Mrna和蛋白质的产生．为此，有必要进一步阐明HGF抑制TGF-β1的分子机制。据报道在肾细胞中，HGF呈上游调节，引起EDA区域产生大量的细胞纤维结合素，而在损伤的肝脏中，EDA纤维结合素的出现与纤维化有关，所以HGF影响星状细胞、以及调节TGF-β和基质蛋白的降解等有关的机制有待进一步弄清[14-16]。3不同基因治疗方案的优越性在理论上有效的抗纤维化治疗需要符合以下几个重要的条件：①有可靠而明确的生物学机制．②必须有药效学上的优势．即活性成分在肝脏中能达到较高的浓度，对肝外组织影响少，如果作用的靶位是星状肝细胞就更好．③治疗的药物应当在作用的靶环境中维持较长的时间，或许在损伤的部位无限期的存在[1]．Qietal报道的方法保证了将目的基因直接运送到肝脏，并获得高水平的表达，重要的是在DMN引起肝脏损伤之前，表达截短的TGF-β受体的AdCATβ-TR就给大鼠预先进行注射，腺病毒载体能至少保持目的基因高效表达1wk～2wk，在DMN处理后的3wk中，产生高水平Ⅱ型TFG-β受体．应用腺病毒载体具有一定优势：①腺病毒对肝细胞有较高的亲和性，并稳定转导肝星状细胞，所以腺病毒载体介导的外源基因易于进入肝星状细胞以及邻居区域的其他细胞(如肝细胞)．②应用腺病毒载体可减少对被治疗的机体产生全身性毒性，因为经过注射腺病毒后主要集中分布于肝脏．虽然不利的因素就是维持基因表达的时间较短，但已经发现有新的载体可维持靶基因长期的表达，或重复注射Liposome介导的基因表达也能达到此目的[1，8]．Fujimotoetal应用含有DNA和HVJ包膜蛋白的脂质体，而将它们直接注射到骨骼肌，这样表达的HGF能进入血液循环，到达肝脏发挥作用，由于这种方法简便、安全、又没有毒性，所以可以用于活的动物模型中．进而通过重复转染HGF基因可以使血浆中HGF持续维持在较高的水平．实验证实重复进行体内转染不会引起显著的炎症反应和小鼠细胞和体液免疫系统的激活[1，2，6]．4应用前景目前，应用转移外源基因进入肝脏的方法和载体系统还受到一定的限制．例如：腺病毒载体由于自身蛋白质有较强的免疫原性而产生细胞毒性、逆转病毒载体虽可用于转移基因到部分切除(而产生再生的)肝脏，但转染的效率相对较低．由于HVJ-脂质体介导的基因转移比直接注射裸DNA的效率更高，这一方法可能较合适应用于人体肝硬变的治疗．上述研究表明抗肝硬变的基因治疗能够阻断肝纤维化的发展、刺激肝细胞的增殖和恢复肝组织结构的完整性，研究进展令人鼓舞．不过另一个值得考虑的重要问题是：抗纤维化的药物有效性的判断是基于实验性肝损伤的基础上，而且在肝损伤的最早期就进行治疗，这对了解药物的生物学活性及机制是有用的，但是：临床上大多数患者通常是已经有肝纤维化才前来就医，这些患者肝脏正在发生进行性炎症和肝纤雏化，应用上述治疗能否有效，是值得深入研究的问题．在我国肝纤维化和肝硬变的发病串较高，其中引起肝硬变的主要原因可能是慢性病毒性肝炎．抗肝纤维化治疗，一要抑制胶原生成、促进肝细胞增生；二是要促进已形成的胶原纤维降解和吸收．才能有效阻断肝硬变的发生．其中特别是有效地抑制肝星状细胞的激活是重要的一环[17]．在我国应用中医中药进行抗肝纤维化治疗，取得一定的效果．由于应用常规的疗法不能治愈肝纤维化和肝硬变，所以依靠基因分子生物学的进步，相信在不久的将来，应用HGF或(和)抗TGF-β的基因治疗最终将成为临床抗肝纤维化和肝硬变的治疗方案。作者简介：王福生，医学博士，研究员。中国人民解放军302医院传染病究所副所长，生物工程研究室主任，主要从事病毒和肿瘤分子生物学、发病机制和相关生物治疗的研究，已发表学术论文和专著40篇。参考文献：

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