热休克蛋白的研究进展

　　热休克蛋白（Hsps）是细胞在一些应激条件，如热休克、葡萄糖饥饿或受到病原菌感染时有高效表达的一族蛋白。Hsps有高度的保守性，在不同的菌株中同族的Hsps有很高的序列同源性，而不同族的Hsps之间却无明显的同源性，如Hsp60s和Hsp70s。热休克蛋白不仅在应激条件下有高效表达，而且在正常的生理条侏下，许多热休克蛋白也有组成型表达。它们参与一些重要的细胞生理活动，如蛋白质转位、拆叠和装配，因此又被称为“分子伴侣”。大多数热休克蛋白在正常和应激条件都具有识别非天然蛋白的能力，在受到热休克或暴露于其他形式的环境压力时，许多细胞内蛋白会发生部分或全部变性，此时Hsps可识别暴露于变性蛋白表面的疏水性区域，协助它们进行重新折叠，或者将无法恢复的蛋白质转移给蛋白质降解系统，使之降解，从而可避免细胞进一步受到伤害，因此Hsps对细胞具有保护作用。除此以外，在受到感染和发生自身免疫性疾病时，Hsps可作为一重要的抗原被免疫系统识别，因此其在医学方面的作用也日益受到重视。

　　1 热体克蛋白——蛋白质生物合成过程中的分子伴侣[1]

 　　在过去几年中，对热休克蛋白在细胞生理活动中的重要作用已有了更深入的了解。它们直接参与了从初生链合成到多亚基复合体装配的整个蛋白质生物合成的过程，因此，又被称为“分子伴侣”。目前分子伴侣是泛指参与介导多肽的正确折叠和装配的一类蛋白伴侣的功能主要有两方面，一方面阻断非生产性的蛋白之间的相互作用；另一方面则可把正在折叠的蛋白与其他的蛋白隔离开，使蛋白处于一有利于折叠的状态。因此它们对于生命来说是必需的。大多数分子伴侣是热休克蛋白，如Hsp70s、Hsp60s、Hsp90s、Hsp15-30s和Hsp100s。

　　其他的有伴侣功能的蛋白，如SecB和PapD,主要调节特定的蛋白质的折叠、定位和装配反应，所以最主要的还是热休克蛋白。

　　1.1 Hsp70s

　　Hsp70s在所有真核细胞的腔室中以及至今检测过的所有细菌中都存在，且高度保守。不同来源的Hsp70s有相似的生化特性，都具有高亲和力的ATP结合位点的肽结合位点，Hsp70s可识别非天然和未折叠的蛋白，但它们对处于折叠状态的蛋白却几乎无识别能力。这说明Hsp70s与蛋白的结合是依赖于对未折叠状态的识别，而不是对特定序列的识别。Flynn等证明8～25个残基的肽段可以结合到细胞质的Hsp70s族Hsc蛋白和内质网的BiP上，并可刺激它们的ATPase活性。Hsp70s与初生蛋白结合主要是为了防止在合成过程中蛋白质发生成熟前的错误折叠和凝聚，并且使新合成的肽链处于一松散构象状态，以利于进一步的折叠或移位过程的进行。

　　1.1.1 E.coli DnaK DnaK最初是作为λ噬菌体DNA在E.coli中复制所需的一种宿主基因的产物而为人们所认识的。它在正常的细胞生理活动中也有非常重要的作用。DnaK基因突变会导致 e.coli的温度敏感生长。 E.coli的合成会因胞内变性蛋白的积累而增加。1988年Clarke等发现DnaK可与在E.coli中表达的外源真核蛋白结合，Phillips等在1990年则发现DnaK的过量表达有助于lacZ杂合蛋白穿过细胞的内膜运往胞外。这些观察都表明DnaK在调节胞内蛋白与蛋白之间的相互作用方面有重要作用。在噬菌体复制时， dnaK与其他两种热休克蛋白DnaJ和GrpE协同作用，参与该过程，而且它还可与DnaJ共同作用活化与质粒P1复制有关的起始蛋白RepA。在这两个过程中DnaK的作用是依赖于ATP的，而且DnaJ和GrpE的存在对它的功能也是必需的。体外实验已证明，DnaK的活性在DnaJ和GrpE存在时可提高50倍。此外，DnaK可保护酶在体外时免受热失活。这种保护作用不需ATP；另一方面，DnaK也能通过溶解高温下形成的聚合体，使热失活的聚合酶重新恢复活性，这一过程则依赖于ATP水解反应。Pierpaoli[2]等应用荧光光谱分析研究了E.coli中DnaK/DnaJ/GrpE系统与肽结合、释放的作用过程，基本过程如下：（1）ATP水解，并使DnaK构象发生改变，这种状态与GrpE和肽的结合能力比较弱，但与DnaJ却有很强的结合力；（2）DnaJ与DnaK结合后，可使DnaK的构象发生变化，从而有利于其与肽发生结合，这一反应虽然速度较慢，但DnaK与肽的亲和力却非常高；（3）在DnaJ的作用下，DnaK恢复成原来的构象状态；（4）肽从复合物上脱离。过去认为DnaK仅与一引起疏水性氨基酸如Ile、 leu、 Ala有作用，但是最近发现DnaK上也有亲水性氨基酸Lys和 arg的结合位点，而且当其疏水性氨基酸结合位点被占据以后，DnaK与Lys和Arg的结合能力会随之增强。

　　1.1.2 酵母中的HsP70s 酵母中有八种HsP70s，其中Ssclp位于线粒体基质中，Kar2p位于内质网腔中，其余六种位于胞质中。

　　1.1.2.1 Ssclp 它和E.coli中的DnaK最为接近，这与内共生假说一致。基因破坏实验说明Ssclp对所有生长条件下的细胞都是必需的。若Ssclp失活则会导致线粒体的蛋白质运输发生障碍，说明Ssclp在进入线粒体中的蛋白的膜转位和折叠过程中起重要作用。

　　1.1.2.2 Kar2p Kar2p参与蛋白进入内质网的转位作用，它与Ssclp功能相似，哺乳动物细胞中在内质网定位的HsP70s又称为BiP，它可与未装配的免疫球蛋白重链分子结合，而对免疫球蛋白无结合能力，说明BiP在蛋白质装配过程中有重要的作用。又因它也是一种葡萄糖调节蛋白，所以又被称为Grp78。它与酵母中的Kar2p一样，也可被各种应激条件所诱导，如葡萄糖限制，分泌前体的积累等，它们可使已合成的蛋白处于一松散状态直至其他亚基合成完毕才装配形成复合体，并且可把异常蛋白运输到内质网降解系统，使之降解，以免对细胞造成进一步的损害。

　　1.1.2.3 胞质中的HsP70s 它属于ssA和ssB两个亚族，其中ssA亚族包括四种蛋白，其表达受热休克诱导，而属于ssB亚族的两种蛋白却在热休克时关闭。ssA亚族对于酵母来说是必需的。体外实验证明，ssA亚族对蛋白进入内质网和线粒体的蛋白转位及发生正确折叠有重要的作用。添加ssA可使转位作用加强，推测它们可能是通过使未折叠前体处于一松散的有利于转位的状态而起作用。

　　1.1.3 哺乳动物胞质中的Hsp70s 在哺乳动物细胞中发现了一类广泛存在的热休克蛋白--Hsp110，它属于HsP70s的一个亚族。体外热变性实验和重新折叠分析表明，Hsp110在选择性地识别变性蛋白和使它们维持一可溶性的折叠感受态方面，比Hsp70更为有效。因而Hsp110是哺乳动物细胞内很重要的一种分子伴侣，它是细胞保护和修复变性蛋白的一个重要工具。

　　1.2 Hsp60s 又称为 Chaperones60(Cpn60)。所有的Hsp60s除了一级结构相似以外，它们的二级结构也都是由两个各含有七个亚基的环所组成。体外和体内实验都已证明，Hsp60s可与未折叠蛋白结合，并且可降低折叠时的能量障碍或降低中间物对凝聚的敏感性。除此以外，Hsp60s还协助某些蛋白，如细胞色素从基质到线粒体内膜空间的运输。

　　1.2.1 GroEL GroE蛋白是E.coli中主要的热休克蛋白之一，它包括65kDa的GroEL与15kDa groES两种蛋白质。其中GroEL与真核细胞中的 Hsp60s有很强的同源性，它与GroES共同协助蛋白质的折叠和装配过程。基因缺失实验表明[3]groEL和groES对细胞在任何温度下的生长都是必需的。groEL或groES突变会降低DNA和RNA的合成速度，而且在非允许温度下细胞不能进行正常的分裂。GroE蛋白在E.coli的噬菌体形成过程中也有作用。GroEL和GroES的过量产生可通过促进突变蛋白的正确折叠或装配来抑制许多基因的温度敏感突变。

　　早期在E.coli中表达真核蛋白时，发现异源蛋白在E.coli中合成的量比较理想，但由于它们在细菌中易形成包含体，阻碍了它们进一步发生正确折叠，而使这些蛋白无法运输到胞外。为解决这一难题，过去常用尿素溶解这些包含体，然后再在体外还原，这样处理之后得到的蛋白量就很少了。实验发现，GroEL和GroES的过量表达可以防止包含体的形成因此将来GroE过量生产菌在提高细菌中外源蛋白的生产方面是很有前途的。

　　1.2.2 最近在不同的生物体的线粒体中都发现了Hsp60s，它们在热休条件下，可占到细胞总量的1%。酵母线粒体中的Hsp60s是由核MIF4基因编码的。该蛋白质的氨基端有一线粒体定向的序列。这段序列在其进入线粒体后即被切除。Hsp60s可以装配成由两个各带有7个亚基的圆环压缩而成的聚合体。这个过程可能由功能性的Hsp60s自身来完成。mif4基因的突变是一致死性突变，这种突变体可以进行蛋白质的运输，但在进入线粒体后，不能进行正确的折叠和装配。最近，在真核细胞的胞质中发现了一种TCP1复合物，实验证明它与在细菌、酵母和真核细胞器中发现的Hsp60s有较强的同源性。而且Liang[4]等还发现胞质中的这种Hsp60s可参与细胞骨加架蛋白如微管蛋白、肌动蛋白的合成。并且TCP1复合物是一中心体组分，因而很明显参与了微管的核化过程。其他的分子伴侣，如Hsp60s、Hsp90s和smHsp在形成和保护细胞骨架方面也有非常重要的作用。

　　Hsp70s和Hsp60s都广泛存在于细菌和真核生物的线粒体和叶绿体中，但它们是相对独立的。在线粒体中，Hsp70s在蛋白转位之前与之结合，Hsp60s则在稍后的阶段加入。有趣的是，NMR研究发现与DnaK结合的肽段处于一伸展状态。而与GroEL结合的肽则处于一α螺旋状态。而且两种蛋白在蛋白质折叠过程中的作用也不相同。这种不同是由于它们寡聚体状态的不同造成的。

　　1.3 Hsp90s[5]

　　Hsp90s同Hsp70s一样，在细菌、酵母和哺乳动物中是高度保守的。Hsp90s是一类主要存在于细胞质中的蛋白质。在酵母中主要有两类Hsp90s：HSC82和HSP82，其中HSC82为一组成型表达的蛋白质，而HSP82是受热休克诱导中，在热休克时，其表达量可提高10～15倍。如果这两个基因中的一个失活，则细胞不能在高于37.5℃下生长,若全部失活则细胞不能生存.目前对哺乳动物细胞中存在的Hsp90s也已进行了深入的研究.这些研究表明,Hsp90s的二聚体与一些蛋白,如Tyr激酶和固醇激素受体有关，因此推测Hsp90s在细胞中通过空间干扰作用阻碍这些蛋白质活性的表达，而且使这些蛋白处于未折叠状态直至其正确定位完成。1989年Bresnick在体外研究糖皮质激素时发现Hsp90s的结合对于糖皮质激素的结合是一必要条件，因为当激素与其受体结合后，Hsp90s即从受体上脱离下来，这促使受体从一非DNA结合状态转变成一DNA结合状态。1996年Freitag等在粗糙链孢菌中发现了一种Hsp80蛋白，这种蛋白是该菌在热休克和碳源饥饿时合成最多的一类热休克蛋白。分析编码该蛋白的基因发现，它与真核细胞中的Hsp90s成员有很明显的序列同源性。通过基因缺失实验发现在该Hsp90s和Hsp70s的功能有重叠，任一基因的单独缺失都不会导致细胞热抗性的消失。而在真核细胞中，至今未发现这种功能重叠现象。生化实验表明，Hsp90s的协助下，变性的柠檬酸合成酶和单克隆抗体的Fab段可重新发生正确折叠。过去对于Hsp90s的分子伴侣活性是否是ATP依赖的问题，一直没有定论，1996年Jokob等[6]用Hsc70和免疫球蛋白作为对照，证实了Hsp90s是不依赖于ATP的。实验证实，Hsp90s不与固定化的ATP结合，也不能特异性地与azino-ATP发生光交联反应，也不与三种荧光ADP类似物结合。这些特性均与人们已知的ATP-independent的免疫球蛋白一致而与ATP-dependent的Hsc70完全不同。而且Hsp90的氨基酸序列也与已知的ATP结合类似物不同，由此可断定高度纯化的Hsp90s是不结合ATP的。而以往有人观察到的Hsp90s与ATP有微弱的结合活性则可能是由于其纯度不高或是由某些与Hsp90s结合的激酶造成的。

　　1.4 smHsp

　　除了以上三类热休克蛋白外,还有一类小分子的具有伴侣功能的热休克蛋白,称其为smHsp.smHsp的作用主要是有效地捕捉未折叠蛋白,并使之处于一有利于折叠的感受态,然后与其他热休克蛋白共同作用,使之进行有效的折叠。在E.coli中的GroES是非常典型的smHsp，它与GroEL协同作用，参与胞内蛋白质折叠过程。在真核细胞中smHsp除了可阻止蛋白质的不可逆凝聚外，它在正常生理条件下的表达水平还与细胞壁的生长分化有关。1989年Gaestel等发现稳定期的肿瘤细胞中smHsp有高活性表达，而且在分化过程中其表达水平也明显提高。Knauf等认为smHsp的过量表达不仅可以提高细胞的耐热性，而且还可以特异性地抑制细胞繁殖。最近几年研究发现[7]，人的α-晶状体与smHsp有很强的同源性，结构研究发现它们都易形成大的寡聚体，而且Leroux已证明这种寡聚体对于smHsp与未折叠蛋白的结合是必需的。Norris在研究鱼的热休克反应时发现，smHsp往往是在其他热休克蛋白的合成降低时才开始。

　　1.5 其他的热休克蛋白

　　当温度突然升高或一个正常的细胞过程发生障碍时，胞内会出现许多未折叠或无功能的蛋白质。这些蛋白质有现两种命运：一是在分子伴侣的协助下恢复它们的天然构象，如E.coli中DnaK能使变性的RNA聚合酶重新恢复构象；二是作为细胞中的垃圾被蛋白酶降解。Hsp104就是E.coli中与蛋白质水解有关的一族热休克蛋白。它由clpA和clpB两种蛋白质组成。其中clpA自身无蛋白酶活性，但具有ATPase活性，所以它可能通过调节蛋白酶clpP的活性来影响蛋白质的降解。

　　泛肽介导的蛋白质水解是真核细胞中蛋白质降解的主要途径。泛肽也是一种热休克蛋白，在进化上有高度保守性，而且在细胞中蛋白酶都是热休克蛋白，它们直接参与水解作用，而且在饥饿条件下也有多种热休克蛋白的产生。它们可增加细胞对饥饿的抗性，是细胞自我挽救时的必要措施。

　　2 热休克蛋白表达的调节[8]

　　最近几年对于热休克蛋白的功能和调节机制有了更深的了解。大多数的热休克蛋白在正常的生理条件下也可产生，虽然量比较低，但在细胞的生理活动中有着非常重要的作用。当细胞暴露于较高的温度时，一套热休克蛋白会迅速地暂时地诱导出来，以应付高温对蛋白质的破坏，这种诱导作用通常发生在转录水平。它们的转录因一些特异性转录因子量的增加而增强。这种特异性转录因子在所有生物中普遍存在。在E.coli中为σ32，在真核中为HSF。一些热休克蛋白，如Hsp70s在诱导产生后，又可对热休克蛋白的合成起反馈调节作用。

　　象其也生物一样，在E.coli中热休克蛋白的暂时诱导是细胞一个非常明显的应激变化。当细胞受到一个比较温和的热休克时，如从30℃转移至42℃，除有些蛋白暂时降低产量外，大多数蛋白不改变它们的合成速率。热休克蛋白的诱导则几乎是在受到热休克后立即发生，在5分钟内达到最高值，并且在20～30分钟内降到一新的稳态水平。当细胞置于一致死温度时，如50℃则大多数蛋白停止合成，此时细胞内存在的蛋白质多为热休克蛋白。

　　热休克蛋白调节机制研究的一个重要突破是在1975年Cooper和Rueffingher利用一影响高温下蛋白质合成的无义突变株得到的。他们发现在E.coli中存在一种含量很低的32kDa蛋白质σ32。由它参与构成的RNA酶全酶能识别热休克基因的启动子，这类启动子与标准的σ因子所识别的启动子有所不同。在其-35序列前有几个保守残基，在-10序列前有保守的CCCC片段。编码σ32的基因为rpoH,rpoH的突变阻止了热休克蛋白合成的暂时增加，而且实验证明，Hsps的诱导依赖于ropH基因产物合成的量。另外，ropD（编码标准σ因子的基因）的琥珀突变可明显增加热休克蛋白的合成量，这表明rpoH的基因产物σ32可能与标准的σ因子竞争RNA聚合酶核心酶。在稳定生长时，每个细胞只有10～30个σ32因子，这是因为σ32是一种极不稳定的蛋白质，其半衰期很短，为1分钟左右，并且它的合成在翻译水平上受到很大的限制。因此正常生长条件下细胞内σ32的浓度很低。当温度从30℃升高到42℃时，σ32在最初的4～5分钟内稳定性增强，从而可快速积累。然而，这一阶段后，σ32又重新不稳定，这与观察到的σ32的暂时增加一致。

　　DnaK是第一个报道的热休克蛋白的负调节因子，因为dnaK突变株可导致低温下热休克蛋白的水平升高，并且可延长高温时热休克蛋白的合成时间，从而使其总量增加。其他的，如dnaj、grpE的突变都可导致相同的表型。在这些突变株中σ32的稳定性比野生型有明显的提高，其半衰期延长10～30倍。而且因为这几种热休克蛋白都不是蛋白酶，所以，推测他们可能直接与σ32结合，然后把它转移给一个蛋白质降解系统使之降解。实验发现E.coli被λ噬菌体侵染后可表达高水平的热休克蛋白，因为λⅢ蛋白可能对σ32的稳定性有增强作用，从而使热休克蛋白的量有所增加。

　　3 应用

　　当细胞受到热休克，或暴露于其也形式的压力条件下时，胞内许多蛋白会发生部分或全部的变性，而热休克蛋白可识别变性蛋白表面的疏水区域，加速它们的重新折叠，并防止不可逆的凝聚反应发生，这种能力说明了热休克蛋白在细胞受到损伤时可有效地保护细胞。大量研究证实，细胞在正常致死温度下存活的能力与热休克蛋白的积累有关，如体温升高会引起Hsp70s的表达的增加，或导致它们在某些细胞类型中过量表达，从而增强细胞对TNF-α引起的毒性效应的抗性，而且已经证实Hsp70s的过量表达可提高紫外线照射后细胞的存活率。大量的体外模型系统正在研究将Hsps用于移植过程中器官的保护以及保护组织免受缺血和神经伤害[9]。由于Hsps具有分子伴侣活性，因而其在蛋白质工程方面的作用早已引起人们的重视。Ryan等发现在热休克条件下进行先期诱导培养，对于在E.coli中人的重组蛋白的表达和其转译后修饰有非常重要的作用。翻译后修饰的程度与特定的热休克蛋白的浓度有关，而且实验发现不仅重组蛋白的表达加强，这些蛋白的同质性也有提高，从而有利于后处理过程的进行[10]。

　　另外，热休克蛋白可能代表了一类新的免疫抑制剂结合蛋白：15-DSG结合蛋白。15-DSG可与Hsp70s、Hsp90s发生特异性结合，而且DSG与它的结构类似物的免疫抑制剂活性和它们与热休克蛋白的亲和力有关，但具体作用机制至今还不清楚。不同的热休克蛋白可与不同的免疫抑制剂发生结合，因此，热休克蛋白可能为新的免疫抑制药物提供了靶子。

　　已经证实当人受到细菌和寄生虫感染时，这些病原体来源的热休克蛋白一种非常重要的抗原。到目前为止，已经报道了有24种感染性疾病的免疫应答是针对热休克蛋白，如结核病、麻风病等，其中对Hsp60s的免疫应答最多。热休克蛋白能作为免疫系统识别的重要抗原的原因有两个：一是当病原体被巨噬细胞吞噬时，它表达高水平的热休克蛋白；二是在不同的病原菌中，热休克蛋白是高度保守的，因此免疫系统可很方便地识别这些高度保守的分子。事实证明Hsp60s在许多感染中都是一免疫优势抗原，它与细胞有免疫交叉活性，而且与一些自身免疫性疾病如IDDM有关。将来的研究将有助于阐明Hsp60s在自身免疫性疾病的作用，并可导致以Hsp60s为基础的针对某些自身免疫性疾病的免疫治疗方法的发展。

　　最近热休克蛋白作为一种可增强肽或多糖免疫原性的佐剂已引起人们的重视。虽然这种载体效应会因可能引起对自身热休克蛋白发生免疫答而冒一定的风险，但是它为疫苗的开发提供了一种新的思路。

　　热休克蛋白参与了多种生物和免疫应签过程，而且在许多疾病治疗方面有很大的潜力。用一些化学物质或一些其他的方法来诱导产生热休克蛋白，会使生物体对一些破坏性的刺激产生一定的抗性。因而对于一些患有慢性疾病，如糖尿病，心脏病或肾脏疾病的人可以考虑通过诱导其体内的Hsps的产生来加以治疗。最近Vigh等利用一种新的细胞保护性的羟胺衍生物来诱导。而且热休克蛋白也因此可被用作抵抗心血管和神经损伤疾病的有效手段。在器官保存和移植方面，热休克蛋白也有一定的应用价值。虽然热休克蛋白的应用有事实上的风险，但它在治疗癌症以及自身免疫性疾病方面有很大的潜力，随着对热休克蛋白调节机制的进一步了解，热休克蛋白的应用一定会越来越广泛。