松果腺褪黑素与肾脏

　　长期以来，松果腺一直被认为是视觉系统的一个退化器官，自1958年Lerner从牛的松果腺提取物中分离出一种能使蛙皮肤褪色的物质，并命名为褪黑素(melatonin,MT)后，松果腺的功能才重新引起人们的兴趣。40年来，有关松果腺的研究成指数增加。MT除具有抑制性腺、甲状腺、肾上腺功能及镇静、镇痛等作用外［1］，近年还发现，它与炎症免疫过程密切相关，参与神经-内分泌-免疫网络的调节作用，并且是炎症免疫的高位调节点之一［2］。可以说，体内众多器官系统均受到这个内分泌器官的调节和影响。肾脏是机体内重要器官之一，具有排泄、调节和内分泌功能。临床上，各种原因所导致的肾损害极为常见。目前，常见肾损害之一的肾小球肾炎，其病因和发病机理尚未明了，亟待深入研究［3］。晚近，有人注意到［4～11］，MT与肾功能和肾脏疾病间具有较多的联系，我们从这方面的进展做一综述。

　　一、褪黑素与肾小球功能

　　Lang等［4］于1981年首次提出了MT和肾脏的直接联系，他的实验结果表明大鼠肾组织内可能存在MT受体。随后，有作者报道［5］，松果腺切除可诱导大鼠高血压，此时大鼠血浆MT水平降低，肾素水平增加，外源性补给MT则可逆转高血压，并使得血浆肾素水平下降；另外应用MT治疗原发性高血压患者，可降低患者血压［6］。这些结果都表明了MT对血压具有调节作用。

　　MT和肾小球功能直接联系的实验是血浆MT水平变化可影响动物的肾小球滤过率(GFR)。有人发现，澳大利亚母羊GFR夏天比冬天高2～2.5倍，但巴基斯坦母羊的情形则与之相反。这些现象提示，季节和光照时间的差异可影响动物的GFR。众所周知，松果腺MT的分泌有明显的节律性，且受季节、光照时间等因素的影响。例如，一天之中，血浆MT水平昼低夜高，且午夜时有一峰值；一年之中，夏天光照时间长，血MT水平低，冬天光照时间短，故血浆MT水平高。为了证实血MT水平的变化和GFR之间的联系，日本学者Tsuda等［7］进行了深入研究，得出了以下结果：(1)东京的母羊，夏天(6～8月)的GFR显著高于冬天，相应的母羊在夏天血MT水平明显低于冬天；(2)在20℃时，依光照时间不同将动物分为三组，即明暗之比为24h∶0h、12h∶12h和0h∶24h组，持续时间均为1周，结果0h∶24h组GFR显著低于其它两组，此组的血MT水平亦最高；(3)更进一步，给三组大鼠连续静脉输注MT(20μg/h，每天16小时,共7天)，在24h∶0h组，其GFR显著低于未输注组，但0h∶24h组，输注组与未输注组GFR相近。这些研究证实了血MT水平的变化在不同季节、光照周期时诱发GFR改变中起了重要作用，但血MT浓度增加引起GFR降低的机理目前尚不清楚。

　　二、褪黑素与肾小管功能

　　正常人夜间钠、钾、氯和尿酸的排泄量仅为白天的50%，而松果腺MT的分泌节律是夜间显著高于白天。以豚鼠为例［12］，午夜时血清MT为72.05±8.61pmol/L(n=15)，中午时血清MT为50.34±5.64pmol/L(n=20)，故推测MT浓度的改变可能是影响尿产物节律改变的原因之一。进一步，Richardson等［13］给叙利亚仓鼠皮下注射MT以观察其对水盐代谢的影响。结果发现，给药组仓鼠摄水量增加，尿钠、钾浓度降低，其时血浆抗利尿激素(ADH)较给药前下降99%，有趣的是垂体后叶ADH含量却显著增加。然亦有相反的报道，Karppanen等发现切除大鼠松果腺后，尽管大鼠摄水量和尿量增加，但尿钠、钾排泄量降低。这些相互矛盾的结果可能源于动物种类差异和(或)实验设计的不同。

　　肾脏和其它几种激素共同调节血液中多种离子的水平，其中肾小管的重吸收和分泌起主导作用。实验证实，MT可调节血液中阳离子的水平［14］。持续光照(功能性松果腺切除)大鼠，可改变血钠水平，增加血钙、镁和锌水平；给予MT则降低血清镁、钙和锌水平，不改变血钾、氯水平。MT如何影响血清离子水平和肾小管功能，目前仍不清楚，可能的机理是：(1)MT直接作用于下丘脑视上核和室旁核，抑制ADH分泌和(或)合成；(2)肾组织中存在MT受体，再经一系列受体后效应发挥其生物学作用。

　　三、褪黑素与慢性肾功能衰竭

　　慢性肾功能衰竭(CRF)患者常表现各种内分泌紊乱和下丘脑-垂体轴功能抑制，如甲状腺功能异常、生长发育迟缓、性功能减退和胰岛素抵抗等。另外，终末期肾脏疾病患者多伴有睡眠障碍、智力减退、自杀倾向以及细胞免疫功能减弱。所有这些临床和生化改变，与MT平衡失调所引起的结果非常相似。事实上，已有实验结果证实了两者间的联系。南非医生Viljoen等［9］检测了110例不同CRF患者明相(上午7∶00～8∶00)血浆MT水平，结果发现，接受内科保守治疗和血液净化治疗的所有CRF患者，其明相血浆MT水平明显增加，为正常人2倍以上，且与病人的内生肌酐清除率呈负相关。作者推测血浆MT水平增加主要是由于肾脏的清除功能减退，肾移植成功后，则MT水平下降；进一步研究CRF患者暗相的MT分泌节律发现，所有血透患者和大部分肾移植后患者其午夜时峰值缺如，可能的原因是夜间氮乙酰转移酶(NAT)活性降低，后者是松果腺内MT合成限速酶。但Vaziri等［10，11］的结果则与Viljoen等的报道相抵触。他们研究了11个长期维持性血透患者明相血浆MT在血透前后的变化。结果表明，CRF患者在透析前(上午6∶00)和透析后(9∶00)其血清MT水平与正常人相比无显著性差异。为了深入研究CRF时MT的代谢异常，他们观察了促红细胞生成素(EPO)对慢性肾衰大鼠MT分泌节律的影响。结果发现，肾衰大鼠明相血清MT水平和暗相血清MT峰值水平及松果腺MT含量均明显降低，给予EPO治疗后，在贫血纠正的同时，可部分纠正上述指标。CFR时MT水平和节律异常的病理生理机制和此时MT补充的潜在价值尚需进一步研究。

　　四、褪黑素对肾损害的保护作用

　　迄今为止，有关MT保护肾损害的报道甚少，Daniels等［15］研究MT是否能阻止四氯化碳诱导大鼠肝脂质过氧化损害时发现，给予大鼠腹腔内注射四氯化碳(5mg/kg)前30分钟和注射后60分钟，分别腹腔内给予MT(10mg)，结果同未注射组相比，肾组织内脂质过氧化水平明显降低，表明MT可能具有较强的清除自由基能力。事实上，MT的抗氧化作用、并作为一种新的自由基清除剂已经得到肯定［16～20］。

　　特殊的微病毒持续感染可诱发动物高丙球蛋白血症，免疫复合物沉积于肾、肝、肺和血管壁，导致多脏器损害，称之为Aleutian disease(AD)。各种类型的水貂均易染此病，且患AD病的水貂死亡率甚高。给某些野生型和半野生型水貂预防性应用MT后，可使水貂的感染率降低；即使部分动物感染了AD，其肝、肾、肺损害程度亦明显减轻，感染后的死亡率下降［8］。这一保护作用的机制目前尚不清楚，可能与MT的清除自由基、调节机体免疫功能等有关。

　　五、松果腺褪黑素影响肾脏机能机制的研究

　　1.肾组织内褪黑素受体：过去的数十年内，有关MT的研究多局限于功能水平；直到Vakkuri等成功地合成了2-碘褪黑素，继之合成碘标褪黑素(2-125I Iodomelatonin)后，使得人们转而研究MT的作用部位［21～23］ 。碘标褪黑素与最初使用的氚标褪黑素(3H-melatonin)相比，具有比放射活性高、特异性强、敏感度高的优点，两者的比放射活性分别为2200和2220MBq/mmol，最低可检出MT结合位点数量分别为0.1fmol/mg蛋白和0.1pmol/mg蛋白。因此使用碘标MT后，相继在鸟类、哺乳类动物和人类的中枢神经系统如脑、垂体和视网膜等部位发现了MT结合位点。随后又在外周组织如免疫系统、生殖系统、肠道、血管等部位证实了它的存在［24］。

　　前已述及，MT与肾脏的病理和生理过程密切相关。MT的中枢和外周结合位点的存在，使人们考虑到肾组织内可能存在MT结合位点。事实上，近年来，Song等［12，23，24］先后在鸡、鸭、豚鼠等肾组织内发现了MT结合位点，且位点与配体的结合具有饱和性、时间依赖性、特异性和可逆性等特点。按最大位点结合数量的多少顺序排列为鸭、鸡和豚鼠。以鸭肾结合位点的研究为例，体外结合试验表明，碘标MT与鸭肾结合位点的结合可稳定2～3小时。结合后2小时，加入非标记MT可以使碘标MT与位点分离，分离速度与结合速度相同。饱和性研究证实，配体与位点结合的Kd值为44.6±4.4pmol/L，Bmax值为6.43±0.60fmol/mg蛋白。药理学试验表明，MT、2-碘褪黑素、6-氯褪黑素、6-羟基-5-羟色胺及氮乙酰-5-羟色胺均可抑制碘标MT与其位点的结合。这些特点符合受体的基本特性。有趣的是鸭和鸡肾MT结合位点的数量明相时显著高于暗相。这与一些文献报道的中枢MT结合位点的昼夜变化相一致，但与MT分泌的昼夜节律正好相反。这种受体数量的变化是由MT分泌波动引起抑或受组织细胞本身改变影响尚待进一步探讨。另外，与鸟类截然不同的是哺乳类动物豚鼠肾组织MT结合位点的数量无昼夜时相的变化。这一差异的原因可能是源于不同的种族和(或)不同的受体类型，亦需深入研究。

　　Song等［12］研究豚鼠肾内碘标MT受体分布时发现，89.7%MT受体位于肾皮质，10.3%位于髓质，亦即肾内MT受体呈不均一性，皮质远远大于髓质，前者为后者8倍以上；肾组织MT受体分布的亚细胞水平研究显示：细胞核占59.3%、线粒体占22.3%、微粒体占18.3%、胞浆内则未发现MT受体。类似的发现亦见于兔和人胚胎肾组织［25，26］。这种不均一分布的生理意义目前尚不清楚，Pang等认为一个可能的意义是影响肾素分泌，进而调节肾小球及肾小管功能。

　　Dubocovich等［21］根据MT受体与配体结合的亲和力和药理学特性的不同，将哺乳类动物脑组织的MT受体分为两种类型，一种是高亲和力受体(ML-1)，另一种是低亲和力受体(ML-2)。Pang等［27］则认为，鸟类和哺乳类动物肾组织内的MT受体为ML-1型。进一步研究［21，24］5-氧-3-硫三磷酸鸟苷(GTPrS)对肾组织内碘标MT受体的影响时发现，MT受体与G蛋白偶联，cGMP可能是MT受体的第二信使，并且依照不同动物肾内MT受体对GTRrS的不同反应分为三个亚型，影响MT与配体结合Kd值者为ML-1α亚型，影响Bmax者为ML-1β亚型，对两者都影响则为ML-1γ亚型。据此，鸡肾内MT受体为ML-1γ亚型，豚鼠肾组织和人胚胎肾HEK293细胞表面为ML-1α亚型。最近，Song等［260］已克隆出豚鼠肾内MT受体，其本质是一种分子量为37000的蛋白质，定位于肾皮质近端小管外膜，与血浆G蛋白偶联，同脑组织内的MT受体本质相同。

　　总而言之，进一步研究MT受体的病理生理作用，MT受体的详尽细胞内信号传递系统，不同环境条件下MT受体的调节将是未来MT受体研究的方向。

　　2.褪黑素的抗自由基作用：肾损害的自由基学说认为，各种致病因素作用于肾组织，使其产生反应性氧化代谢产物，如超氧化阴离子(O2-)、过氧化氢(H2O2)和一氧化氮(NO)等。这些反应性氧化代谢产物是肾损害的重要介质。正常肾组织具有抗氧化防御系统，能清除或中和反应性氧化代谢产物。当反应性氧化代谢产物产生过多，超越组织细胞清除能力时，它将成为一种致病介质。这些介质可直接或间接毁损细胞膜结构，导致溶酶体释放，细胞死亡；抑或增加DNA突变，引起功能性蛋白质合成误差，从而形成各种急性或慢性肾损害。

　　MT本身具有强大的清除自由基作用［16～20］。Poeggeler证实［20］，MT是一种OH-自由基清除剂，其清除能力是谷胱甘肽的4倍，甘露醇的14倍。Pieri［25］比较了MT与维生素E的清除自由基能力，发现MT清除H2O2的能力是维生素E的2倍，是迄今为止最有效的亲脂性抗氧化剂。除上述体外实验外，一些体内实验亦证实了MT的抗氧化作用。Chen(1994)给动物应用MT，可清除自由基，从而逆转由自由基增多所导致的心肌膜Ca2+泵活性降低。谷胱甘肽合成抑制剂可诱导新生大鼠白内障，Abe等(1994)给大鼠注射MT可清除自由基，防止了新生大鼠白内障形成。

　　进一步研究MT及其衍生物的结构发现，MT的结构与其抗氧化作用关系密切。Tan等的实验显示，MT清除自由基作用依赖于吲哚环上5位甲氧基，其侧链上的乙酰基具有协同作用。作为细胞内自由基清除剂，MT的高亲脂性和部分亲水性，使其易于通过细胞膜，并进一步穿过胞浆进入细胞核，更好地发挥抗氧化作用。MT抗自由基作用的机制，目前仍不清楚。多数学者认为，MT可直接清除自由基；其次，MT与其受体结合，引起细胞内特异性酶改变，进而清除自由基；另外，MT尚可通过不同途径减少多种氧自由基的合成。Pablos等［20］给予鸡和大鼠MT，测定各器官谷胱甘肽过氧化物酶活性，其活性在肾、肝、肺及脑中分别升高37%～300%，揭示MT可以激活过氧化物酶类，使其催化H2O2等过氧化物的活性增加，降低了机体细胞内的H2O2水平，抑制自由基的产生。

　　前已述及 ，Ellis和Daniels等［8，15］亦观察到MT可通过清除自由基而保护肾损害；晚近，更有直接的实验证实了MT在体外和体内均具有抗肝、肾的脂质过氧化作用。然其确切机理尚待进一步探讨。

　　3.褪黑素调节炎症免疫反应：肾损害的免疫学说认为，各种内源性和外源性抗原可启动机体特异性的免疫应答过程，并识别肾组织细胞，激活多种炎性细胞，使其释放各种淋巴因子和炎性介质，如前列腺素、内源性阿片肽、血小板源性凝血因子、活性氧自由基等等，从而导致多种免疫性肾损害。

　　MT与机体免疫功能密切相关。1981年，Manestroni发现，实验性抑制松果腺功能，可导致小鼠体液和细胞免疫功能减退；外源性补给MT则可纠正之。深入研究发现，MT参与神经-内分泌-免疫网络的调控，从不同层次对免疫应答发挥上调作用。首先，MT可在整体水平影响炎症免疫反应。在胚胎期和新生期，松果腺是中枢免疫系统的组成部分；成年期，机体内存在松果腺-胸腺轴，控制着外周免疫器官的发育和成熟。实验还证实，MT可拮抗动物的各种急慢性炎症反应。其次，MT可在细胞及分子水平影响炎症免疫反应。例如它可作用于抗原激活的T淋巴细胞，进而促进抗体生成；增加血中CD 4/CD 8比例；增强NK细胞的吞噬功能；促进巨噬细胞分泌IL-1；参与血小板源性凝血过程等等。

　　目前认为，MT调节炎症免疫的机制主要包括以下几个方面：(1)机体内淋巴细胞表面有MT受体，MT可与之形成稳定的、可逆的、可饱和性的结合，经过一定的信号传递，再发挥其生物学效应；(2)MT本身是一种环氧酶抑制剂，使前列腺素生成减少，炎症免疫功能下降；(3)MT可作用于辅助性T细胞，使之释放内源性阿片肽，继而发挥免疫增强作用［1］；(4)下丘脑、垂体水平有特异性的、高亲和力的MT受体，MT与之结合后，可阻止ACTH生成，抑制肾上腺功能，即松果腺MT可通过下丘脑-垂体-肾上腺轴系统(HPAA)参与神经-内分泌-免疫调节。因此，MT除直接作用于炎症免疫细胞外，还可通过HPAA轴影响炎症免疫反应，故松果腺是炎症免疫的高位调节点之一。

　　六、展望

　　肾脏主司生成和排泄尿液功能，同时也具有调节水电解质平衡和一系列内分泌功能，对维持机体内环境的稳定起重要作用。临床上，各种原因所导致的肾损害常表现为多系统机体功能紊乱。各种常见的慢性肾小球肾炎和其它慢性肾损害，其病变发展多呈进行性、不可逆性，并逐步转化为肾功能减退和慢性肾衰，严重危害人类的健康。至今尚未发现有效的保护剂防治这种进行性肾损害。松果腺MT是一种重要的神经内分泌激素，具有广泛的生物学效应，其靶器官不仅包括中枢神经系统，而且包括几乎所有外周器官和组织，如肝、肠、肺、心脏、血管和免疫系统等，肾脏亦是其靶器官之一。MT可降低正常母羊GFR；增加仓鼠水摄入量和尿量，改变血液和尿液中的离子浓度；在GRF患者和动物，可表现为MT夜间峰值缺如，白天MT水平改变，并与CRF的多种神经内分泌功能密切相关；在肾脏的过氧化损害和免疫损害中，MT可发挥较好的保护效应。因此，松果体MT的研究势必为我们防治肾损害提供了一条新途径。

　　志谢　本文部分参考文献由香港大学Pang SF教授馈赠，特此致谢。

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