肝移植与基因治疗

　　摘要 基因治疗在基础及临床研究方面都取得了很大进展，目前基因治疗应用于动物肝移植的实验研究已经具有可行性，正应用于研究移植物排异反应的机制，并有可能成为诱导免疫耐受的有效方法，对供肝或受者进行基因治疗有望在减少急慢性排异反应、提高移植肝的存活时间等方面取得突破。
 
　　肝移植术后全身免疫抑制剂的应用将导致受者易于发生感染，肿瘤的发生率也显著增加，尚存在肾毒性等副作用[1]。基因治疗所诱导的免疫抑制只发生在移植肝的局部或具有供者特异性，对全身免疫功能影响较小。转导基因所编码的蛋白质能在肝内持续表达。一种转导的基因只编码一种蛋白质，这为研究各种物质在移植免疫方面的作用提供了可能性。另外，基因治疗能在低温下进行，不影响离体肝的功能[2]。肝移植的基因治疗实验研究的主要焦点是主要组织相容性复合物（MHC）和影响排异反应的各种细胞因子。

　　1肝移植基因治疗的载体

　　1.1复制缺陷性逆转录病毒载体

　　采用复制缺陷性逆转录病毒载体转导基因具有构建简单、能有效插入宿主基因组、病毒不复制和可持续表达等优点，但它只能在细胞处于分裂期才能将基因整合入细胞染色体。Abraham等在对供肝大鼠行半肝切除24小时后切取供肝，以诱发肝细胞增殖，再用含有逆转录病毒载体的保存液低温灌注供肝，然后行原位肝移植术，发现所携带的目的基因持续表达至术后21天，转导效率为1%~3%[3]。因为临床上诱导供肝细胞增殖的可能性较小，所以它的应用受到限制。

　　1.2复制缺陷性腺病毒载体

　　已构建好的复制缺陷性腺病毒载体一般缺少整个E1a和部分E1b基因，需生长在含有Ad5的E1区的293细胞中，而不能在不表达E1功能的细胞中复制。它能有效地转导入静息细胞，而不受细胞周期的影响。另外，它还能在低温下有效地转导肝细胞，这正符合移植肝的保存条件[4]。腺病毒载体不整合入细胞染色体，因而插入突变的可能性也大大减少，但此特性亦导致腺病毒似乎不能在细胞内长期存在。Abraham等用含有腺病毒载体的保存液低温灌注离体供肝1小时，然后行原位肝移植术，所携带的目的基因所表达的重组蛋白在术后24小时至7天均可检测到，转导效率为10%~15%[5]。另有研究表明，转导效率与病毒/肝细胞比率及转导时间直接有关[6]。

　　1.3质粒DNA

　　有报道，应用质粒DNA携带目的基因转导肝细胞[7]，或携带MHC基因直接注射入受者胸腺组织，检测到MHC基因在胸腺组织的表达[8]。

　　2肝移植基因治疗的转导方法

　　2.1间接转导法

　　将目的基因在体外转导入原代培养的细胞（如肝细胞或肌细胞），然后将靶细胞再转入组织或器官（如肝脏和胸腺等）。将目的基因转导入培养细胞的方法有很多，如逆转录病毒载体介导法、脂质体介导法、磷酸钙沉淀法和电穿击法等。

　　2.2直接转导法

　　即不将目的基因在体外转导入原代培养的靶细胞，而将目的基因直接转导入肝组织的方法，包括复制缺陷性腺病毒载体灌注供肝、肝内注射法、颗粒轰击法及门静脉注射法等。

　　3肝移植基因治疗的目的基因

　　3.1主要组织相容性复合物

　　对自身MHC抗原的免疫耐受是通过将其递呈给未成熟胸腺细胞而使对此抗原有反应的胸腺细胞发生凋亡后而获得，外源性抗原也可通过此途径获得免疫耐受。Knechtle等先转导入受者的肌细胞，然后再将肌细胞注射入受者胸腺组织，并同时皮下注射抗淋巴细胞血清，3周后行异种原位肝移植，发现转导后的受者肌细胞能表达供者的MHC抗原，基因治疗组大鼠的存活时间显著延长，受者的CTL细胞对供者细胞的杀伤力下降至1/10，这种移植物耐受性具有供者特异性[9]。同一小组的研究表明，将含有供肝大鼠种系Ⅰ类MHC的质粒DNA直接注射入受者胸腺组织，并同时皮下注射抗淋巴细胞血清，可以观察到受者胸腺细胞表达供者MHC抗原，7~10天后行异种原位肝移植，13只中有9只存活100天以上。这一供者特异性移植物耐受的产生，可能与对供者的MHC抗原有反应的T细胞克隆的去除及抑制性淋巴细胞的产生有关[8]。

　　3.2细胞因子

　　异体器官移植排异反应与受者的细胞因子网络密切相关，有较多研究表明，Th1细胞因子如干扰素（IFN）、白介素（IL）-2等参与器官移植排异反应，而Th2细胞因子对IL-4、IL-10等可以抑制Th1细胞因子的释放，因而抑制Th1细胞因子的分泌、增强局部或系统Th2细胞因子的水平将有助于减少排异反应的发生[10]。David等将Th2细胞因子IL-4、IL-10的基因转导入移植肝，认为这是上调移植肝局部的免疫抑制的可行方法[11]。转化生长因子（TGF）-β1能抑制细胞免疫功能，能显著抑制CTL和NK细胞的活性，并能延长移植物的存活时间。Kenneth等将含有TGF-β1 cDNA的腺病毒转导入移植肝，采用RT-PCR可以在术后1~5天探测到TGF-β1 mRNA在移植肝内的表达，TGF-β1的增高是与局部肿瘤坏死因子（TNF）-α和INF-γ的下降密切相关，而后者可能与诱发器官移植排异反应有关[12]。

　　3.3反义核酸和反义核酸酶

　　在异种移植中抑制或敲除编码主要异种抗原Gal的α（1,3）半乳糖苷转移酶基因能够抑制超急排异反应，Hayashi采用针对这种基因的反义核酸酶转导猪和小鼠，发现Gal的表达下降。他们认为在异种移植中除了转基因和基因敲除技术外，腺病毒基因转导技术也有望抑制超急排异反应的发生和发展[13]。

　　4存在的问题和前景展望

　　基因治疗在肝移植中的应用尚处于实验阶段，此疗法付诸临床试验还为时过早，因为治疗本身尚有很多问题亟待解决。如（1）目前转导技术基因表达率相对较低；（2）目的基因表达时间相对过短；（3）为了延长目的基因表达时间，有必要反复转导病毒载体，但是机体可能对此载体产生免疫反应，从而限制了病毒载体的再次应用[14]；（4）对于MHC抗原的合适形式、定位和剂量等尚缺乏很好的理解；（5）尚未明确器官移植排异反应过程中各种细胞因子的作用及相互关系。随着基因治疗技术的成熟，可能会发现一种更有效、安全及能长期表达的载体或转导技术，对器官移植排异反应机制的深入研究，将有助于对MHC及细胞因子网络的理解。基于基因治疗在肝移植中的应用有诸多优点，将具有广阔的前景。