微囊化大鼠胰岛异种移植治疗小鼠实验性糖尿病的研究

　　【摘要】　目的　研究海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠包裹胰岛进行移植的效果。方法　将Wistar大鼠的胰腺先行胶原酶胰管内注射消化，然后分离、纯化，所得胰岛经培养后制成微囊包膜的胰岛，微囊直径为0.4～0.5 mm，每个微囊内包含1个胰岛。将微囊包膜及非包膜的胰岛移植至小鼠腹腔内，每个受体的移植量约1 000个胰岛。术后不用免疫抑制剂。结果　微囊化的胰岛分别置含葡萄糖5.6 mmol/L和16.7 mmol/L的无血清TC199培养基中培养，其胰岛素的释放量，包膜组与非包膜组相比，差异不显著(P＞0.05)。微囊化胰岛移植组术后3天非空腹血糖从(22.0±0.51)mmol/L降至(7.8±0.48)mmol/L，维持正常血糖的时间平均为126天；单纯胰岛移植组术后移植物有功能存活不足8天。结论　微囊化胰岛移植后可在不使用免疫抑制剂的情况下延长胰岛移植物的存活时间，逆转高血糖。

Xenotransplantation of microencapsulated rat islets to treat experimental diabetes in mice

ZHOU Maohua*, CHEN Dongming, XIA Zhaoji, et al. *Department of Surgery, Medical College of Chinese People's Armed Police Forces, Tianjin 300162

　　【Abstract】　Objective　To study the effects of alginate-polylysine-alginate(APA) microencapsulated islet in xenotransplantation.Methods　Islets were isolated from Wistar rat pancreas by ductal injection of collagenase, digested, and purified by using Ficoll gradient. After cultured, the islets were encapsulated in PAP semipermeable membranes. The microencapsule had a diameter ranging from 0.4 to 0.6mm with each microencapsule containing one islet. 1 000 encapsulated or non-encapsulated islets were intraperitoneally transplanted into the diabetic mice in the absence of immunosuppression.Results　There was no significant difference in insulin secretion between the encapsulated islets and non-encapsulated ones (P＞0.05). Diabetes was reversed within 3 days after transplantation of encapsulated islets with the fasting plasma glucose levels being dropped from (22.0±0.51)mmol/L to (7.8±0.48)mmol/L and maintaining a mean normoglycemia for 126 days. While the non-encapsulated islets only functioned less than 8 days posttransplantation.Conclusion　The encapsulated pancreatic islets，semipermeable membranes，can effectively prolong the xenograft survival without immunosuppression, and reverse hyperglycemia in diabetic mice.

　　【Key words】　Islands of Langerhans/transplantation　　Transplantation, heterologous　　Diabetes mellitus, experimental　　Immunologic technics

　　如何消除或避免排斥反应是胰岛移植面临的一个重要问题，免疫隔离技术是较理想的方法。本实验采用海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠包裹成年Wistar大鼠胰岛，移植到实验性糖尿病小鼠模型腹腔内，取得满意的效果。

　　材料与方法

　　一、动物和试剂

　　供体为Wistar雄性大鼠，体重250～300 g，受体为纯系C57BL/6雄性小鼠，体重18～20 g，由北京医科大学科学动物部提供。RPMI 1640培养基、TC199培养基、胎牛血清、Ⅺ型胶原酶(1 660 U/mg)、链脲霉素、L-多聚赖氨酸、海藻酸钠、Ficoll-400均为Sigma产品。微量血糖测量仪Ⅱ为澳大利亚Miles产品，胰岛素放射免疫测试药盒为中国原子能科学研究院产品。

　　二、大鼠胰岛的分离与纯化

　　按Sutton等［1］的方法稍加修改，采用0.5g/L的Ⅺ型胶原酶液胰管内注射消化大鼠胰腺，分离胰岛，Ficoll不连续密度梯度离心法纯化。纯化的胰岛置含5%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养24小时，待微囊制备。

　　三、微囊化胰岛的制备

　　采用Sun等［2］的方法加以改良，在气流式微囊形成仪中，胰岛依次悬浮在海藻酸钠、多聚赖氨酸、海藻酸钠溶液中，在胰岛周围形成海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊膜。不同之处是本实验整个成囊过程中均将95%O2和5%CO2通过成囊溶液，使其保持生理pH；成囊步骤所用的液体不用生理盐水，而改为具胶体渗透浓度的缓冲溶液，更符合生理要求。成囊后培养24小时待移植。

　　四、电镜标本制作

　　将微囊化胰岛用12.5 g/L戊二醛固定，超薄切片。

　　五、胰岛素释放试验

　　精心挑选100个直径为200～250 μm纯化的胰岛，微囊化后分别置含低糖(5.6 mmol/L)和高糖(16.7 mmol/L) 的无血清TC199培养基中，在37 ℃、5%CO2培养箱中孵育24小时，测定培养液中胰岛素的含量。胰岛素测量采用间接放射免疫法。

　　六、糖尿病模型的制备与异种移植

　　受体小鼠按220 mg/kg腹腔内注射链脲霉素，剪尾取血，每周测3次空腹血糖浓度，若连续2次大于20 mmol/L，则定为实验性糖尿病动物模型。模型制备后置代谢笼中饲养。随机将模型分为4组，每组10只，即微囊化胰岛移植组、单纯胰岛移植组、空微囊移植组、模型对照组。在乙醚麻醉下行腹腔内移植，每组按要求各自用14号针头注入培养24小时的微囊化胰岛、单纯胰岛、空微囊1 000个、相当体积的组织培养基。移植后不使用免疫抑制剂，每周测血糖浓度2次。血糖降低后，若连续2次血糖高于11 mmol/L，则将第1次的时间定为排斥反应开始。

　　七、统计学处理

　　所有数据均采用样本均数±标准误表示，t检验法统计学处理。

　　结　　果

　　一、胰管注射胶原酶、胰腺静止消化情况

　　大鼠胰腺经胰管原位注射胶原酶消化、Ficoll纯化后，在倒置显微镜下可见大量表面光滑、大小不等、呈淡黄色圆形或卵圆形的胰岛。胰岛的收获量为610～820个胰岛/胰腺，纯度可达92%。

　　二、微囊化胰岛的观察

　　倒置显微镜下见微囊化胰岛呈球形，表面光滑，富有弹性，光泽、大小均匀，直径约0.4～0.5mm，每个微囊内包含1个胰岛。

　　三、电镜观察

　　微囊化胰岛的B细胞胞质中充满胰岛素颗粒，A细胞的结构完整，胞质中富含胰高血糖素颗粒。

　　四、胰岛素释放试验

　　葡萄糖刺激胰岛素的释放量，微囊化胰岛与单纯胰岛相比，差异无显著性(表1，P＞0.05)，其分泌胰岛素的功能可持续达4个月。各组内胰岛素的释放量，高糖组与低糖组相比，差异有显著性(P＜0.01)。提示微囊化胰岛的B细胞功能良好，与单纯胰岛相比，差异无显著性。

表1　经培养胰岛的胰岛素释放试验

组　别	n	24小时的胰岛素释放量(mIU/胰岛)
		高　糖	低　糖
微囊化胰岛	6	221±34.5	124±29.9
单纯胰岛	6	230±29.5	110±26.2

　　五、体内实验

　　微囊化胰岛移植组，受体3天内平均非空腹血糖从(22.0±0.51)mmol/L下降至正常范围(7.8±0.48)mmol/L，维持正常血糖时间最长可达160天，平均126天，尿量减少，体重增加，尿糖转阴，这一结果明显优于单纯胰岛移植组(其移植物有功能存活不足8天)。对照组的糖尿病状态无自然缓解，直至死亡。各组术后的血糖变化见图1。

 

图1　各组动物术后血糖的变化曲线

　　六、移植物的观察

　　微囊化胰岛移植组，移植后3周，取出2只受体体内的微囊化胰岛，其糖尿病症状随即出现，重新移植后，糖尿病状态又得到纠正。取出的微囊化胰岛，光镜下可见微囊膜完整，表面光滑，无纤维蛋白包裹，囊内胰岛形态结构良好。

　　讨　　论

　　免疫隔离技术是避免移植术后排斥反应的一个重要途径［3］。胰岛移植中所用的微囊的大小可影响胰岛素释放的敏感性，直径为0.4～0.6 mm的小囊可对刺激发生迅速反应，而直径为0.7～0.8 mm的大囊则反应迟钝［4］。微囊形成仪采用注射泵、小内径(0.4 mm)双腔喷口，可制作均匀一致、表面光滑、富有弹性、直径约0.4～0.5 mm的微囊。

　　本实验选择腹腔游离移植，具有安全、简便、易于接近、可重复性等优点。从代谢的观点来看，门静脉系统更适合于临床移植。关于移植胰岛的数量，大鼠腹腔内游离移植4 000～5 000个微囊化胰岛可逆转糖尿病模型的高血糖，小鼠腹腔内游离移植微囊化胰岛1 000个可逆转模型的高血糖［5］。本实验证实了这一点，但必须保证胰岛的功能良好。

　　微囊膜是由阴离子多糖海藻酸钠与阳离子多聚赖氨酸相互作用形成的聚和解质膜。影响微囊膜通透性的因素有：(1)多聚赖氨酸的相对分子质量；(2)多聚赖氨酸的浓度；(3)海藻酸钠与多聚赖氨酸相互作用的时间。鉴此我们选用的多聚赖氨酸的相对分子质量为30 000～70 000，严格控制反应时间，从而改善了微囊膜的性能。

　　理论上采用微囊化胰岛移植具有下列优点：(1)免疫隔离技术的应用可降低免疫抑制剂的用量，有利于消除或减少免疫抑制剂的毒副作用；(2)可保护植入的胰岛免遭受体抗体的损害；(3)解决器官来源短缺的难题，可用于异种胰岛移植。

　　研究结果表明，微囊化胰岛移植可在不使用免疫抑制剂的情况下延长胰岛移植物的存活时间，逆转糖尿病模型的高血糖，为解决移植排斥提供了新的途径。

　　本课题为国家自然科学基金资助项目(基金编号39070827)

　　参考文献

　　[1]　Sutton R, Peters M, Mcshane P, et al. Isolation of rat pancreatic islets by ductal injection of collagenase. Transplantation, 1986, 42:689-691.

　　[2]　Sun AM，Fan MY，Lum ZP, et al. Bioartificial pancreas:reversal of diabetes in BB rats by transplantation of encapsulated pancreatic islets. Artif Organs, 1989, 19:567-573.

　　[3]　Zimmermann U, Klock G, Federlin, et al. Production of mitogen-contamination free alginates with variable ratios of mannuronic acid to guluronic acid by free flow electrophoresis. Electrophoresis, 1992, 13:269-274.

　　[4]　Chicheportichc D, Reach G. In vitro kinetics of insulin resease by microencapsulated rat islets effect of the size of microcapsules. Diabetologia, 1988, 31:54-57.

　　[5]　Sun AM, O'shea GM, Goosen MFA. Injectable microencapsulated islet cells as a bioartificial pancreas. Appl Biochem Biotechnol, 1984, 10:87-99.