小脑移植的基础与临床研究

　【摘要】　目的　为了证实小脑组织移植后移植物在受体脑内是否存活以及植入的神经细胞是否可以纠正和改善小脑功能缺陷和症状。方法　将胎龄为13天的C57BL/6小鼠胚胎小脑组织悬液移植到3个月龄的BALB/c成年小鼠脑内，术后观察1～8周，并进行组织学观察。在动物实验基础上，将胎龄为9～12周的人胚胎小脑组织悬液移植到6例患有严重小脑萎缩的患者脑内。结果　动物实验的组织切片证实移植物在受体脑内再生，并且可见浦氏细胞分化成熟和迁徙到颗粒细胞层。6例患者接受小脑移植后近期疗效良好，症状和体征及客观指标均有改善。经过5～7年随访，仅2例患者疗效稳定。结论　未成熟小脑组织移植后可在受体脑内存活，并且有神经细胞再生和改善神经功能潜力，但术后的排斥反应尚需深入研究。

Embryonic cerebellar cell grafts in basic research and clinical application

WU Chengyuan*, WANG Jiangang, YANG Yang, et al. *Department of Neurosurgery, Affiliated Hospital of Shandong Medical University, Ji’nan 250012

　　【Abstract】　Objective　To verify whether the cerebellar cell grafts to be survival in the recipient brain and the transplanted neurons to correct and improve the cerebellar function disorders and symptoms so as to explore a new way to treat cerebellar lesions.Methods　Embryonic cerebellar tissue suspension from 13-day C57BL/6 mice was transplanted into the injured cerebellum of 3-month BALB/c mice. After operation, observation(including histological observation)was conducted for 1 to 8 weeks. On the basis of animal experiment, 9～12-week human embryonic cerebellar tissue suspension was transplanted into the cerebellum of 6 medically intractable patients with severe hereditary cerebellar degenerative ataxia.Results　The histological observation of the cerebellar tissue in the animal experiment revealed that embryonic grafts could survive and that mitoses of the host Purkinje cells of the implanted group were increased substantially over the control groups. The short-term therapeutic effects were good in the 6 patients following cerebellar transplantation. The symptoms, signs, and objective parameters were all improved to some extent. After 5 to 7 years' follow-up, only 2 patients had a good result.Conclusion　The embryonic cerebellar tissue can survive in the recipient cerebellum and has the potential to regenerate the neurons and improve the nervous function.

　　【Key words】　Cerebellum/transplantation　　Graft survival

　　自1987年4月以来，我院与美国犹他州立大学医学中心合作，进行了胚胎小脑组织移植的动物实验研究。在此基础上，我们对6例重度小脑萎缩的患者进行了胚胎小脑组织脑内移植，现将实验资料和临床资料报告如下。

　　实验资料

　　供体为胎龄13天的C57BL/6小鼠，其细胞采用单克隆抗体蛋白标记。受体选用3个月龄的BALB/c小鼠56只，该鼠的神经细胞不为上述单克隆抗体蛋白所染色。

　　将BALB/c小鼠麻醉后，固定于实验台上，无菌操作下开颅，用特制吸管将C57BL/6小鼠的小脑组织0.3～0.5 ml植入其小脑之内，然后逐层缝合切口。待受体清醒后，放回动物实验室喂养观察。

　　受体在术后1～8周内，每周处死6只，常规方法固定、切片，进行小脑组织观察。结果在移植后6周的标本中发现植入的胚胎小脑组织移植物在受体脑内存活，并且逐渐成熟和分化为不同类型的神经细胞，新生的浦氏细胞群迁徙到受体小脑的分子细胞层内，并发现来自供体的浦氏细胞具有分裂现象和长出轴突和树突(图1、2、3)，单克隆抗体蛋白标记染色证实这些新生的细胞来自于供体(图4)。

 

图1　胚胎小脑移植后8周，小脑移植物在受体小脑内存并与宿主小脑融合（HE×150）

　　图2　小脑移植后，新生的浦氏细胞群迁徙到受体小脑分子屋内（HE×400）

　　图3　来自移植物的浦氏细胞的有丝分裂

　　图4　受体脑内的C57BL/6小鼠的细胞被单克隆抗体蛋白标记染色，证明新生细胞来自移植物（×1000）

　　临床资料

　　一、一般资料

　　本组6例患者，男4例，女2例，年龄12～60岁，50岁以上者2例，病史2～12年。主要症状：进行性行走不稳、动作不灵、语言不清，其中头晕3例，长年卧床不起2例，复视和视物晃动感3例，吞咽呛咳1例，持物不稳、书写困难5例，大小便障碍1例。主要体征：共济失调6例，肌张力降低3例，肌张力升高2例，腱反射亢进2例，腱反射降低或正常4例，6例均无深浅感觉障碍，病理反射阳性1例。6例患者脑CT检查均提示重度小脑萎缩。

　　二、手术方法

　　1. 小脑移植物的制备：取胎龄为9～12周的自然流产的胚胎小脑组织，加入林格氏液5 ml，用10 ml注射器使小脑组织先后经过9号、12号针头，制成胎脑组织悬液。受者的开颅术同时进行。

　　2. 手术操作：患者取左侧卧位，取后颅凹右旁正中切口进颅，骨窗约2 cm×3 cm，骨蜡止血。十字切开硬脑膜，取小脑半球无血管区作穿刺点，用脑穿刺针向小脑上蚓部、前叶、外上绒球部及外下部多靶点微量注射，每例植入胚胎小脑组织悬液3～5 ml。然后用止血明胶海绵封闭小脑表面移植穿刺孔，防止悬液溢出。充分止血，逐层缝合伤口。

　　三、治疗结果

　　术后症状、体征明显好转者2例，稍有好转者3例，1例2个月内症状好转，但疗效不巩固。术后3个月内全部病例症状体征均较术前改善，构音困难好转6例，眼球震颤消失2例，快复动作好转者3例，指鼻试验好转5例，肌张力恢复正常1例，跟膝胫试验好转3例。2例进行了书写对比，1例进步明显，1例无明显改善。术后随访5～7年，其中2例患者病情稳定，1例12岁的患者生活自理，在校学习，并能做部分体力劳动。其余病例疗效退步。

　　5例患者术后的免疫功能无明显变化，1例患者术后第5个月出现外周血免疫球蛋白增高。术后1～6个月，全部病例外周血的抗胎脑抗体及抗核抗体测定均为阴性。3例行胎脑悬液与淋巴细胞混合培养，测定淋巴细胞转化率，与未加胎脑组织悬液者比较，差异不显著。2例测定视觉皮层诱发电位无变化。

　　讨　　论

　　移植免疫学认为脑是部分特免器官，对植入组织和细胞的组织相容性较大。多数作者认为血脑屏障对保护移植物免受排斥，起着重要作用。此外，脑内缺乏淋巴系统，使脑对移植物的潜在性免疫反应较弱［1］。当向脑内移植未成熟神经元时，移植物不仅可以存活，而且还可以保持原来的神经功能特性［2］。脑内移植物的存活在某种程度上取决于能否摄取足够的受体脑中之营养物，特别是氧和葡萄糖。

　　之所以选择小脑萎缩进行尝试性小脑移植研究，就在于小脑解剖学结构比较简单，其功能比较单一，因此比较容易观察和测定胚胎移植物在受体脑内的存活情况和受体的功能改善程度。另外，由于小脑的组织结构，特别是小脑皮质的3个细胞层结构特征性强，所以术后观察和监测移植组织的形态学和发育学变化比较容易。胚胎小脑组织移植可向病变部位提供大量健康的浦氏细胞和原基细胞，这些细胞具有再生和重建功能［3］，因此脑细胞移植治疗小脑萎缩可获一定效果，特别是目前无特效治疗方法的单纯性小脑萎缩和晚发性小脑皮质萎缩应当是本项治疗的首选适应证。

　　胎脑组织悬液移植的效果优于大的固体组织块。移植物制备必须在严格无菌操作下进行，胎脑去除血管及软脑膜，然后制成悬液或匀浆。研究表明，软脑膜及血管组织更容易引起排斥反应［4］。

　　胚胎小脑组织移植后的免疫学监测指标包括：E玫瑰花环形成试验、淋巴细胞转化试验和补体含量测定，以观察受体的细胞免疫状态，评估是否发生排斥反应。

　　本课题为国家自然科学基金资助项目(基金编号39670751)

　　参考文献

　　[1]　Marx JL. Transplants as guides to brain development. Sciencc, 1987, 217:340-346.

　　[2]　Backlund EO, Granberg PO, Knutsson E, et al. Transplantation of adrenal medullary tissue to striatum in parkinsonism. J Neurosurg, 1985, 62:169-201.

　　[3]　菊地康文. 成体ラツト小脑内への胎仔ラツト小脑内移植. 脑神经，1989，41：45-53.

　　[4]　Ahlskog J. Eric:cerbral transplantation for Parkinson's disease. Mayo Clin Proc, 1993, 68:578-591.