移植肾BCL-2及UCHL1的表达及临床意义

　　【摘要】　目的　探讨细胞凋亡与排斥反应、BCL-2及UCHL1表达之间的关系。方法　收集10例手术切除的无功能移植肾病理标本作为实验组，相应的移植术前活检组织作为对照组。采用免疫组织化学染色技术观测BCL-2及UCHL1在移植肾的表达，并观察其组织切片的形态学变化。结果　对照组50%以上的肾小管细胞BCL-2呈阳性表达，实验组BCL-2的表达明显减少(P＜0.01)，尤其是当发生急性排斥反应时；UCHL1的表达，对照组表达UCHL1的T细胞很少，而实验组的阳性表达细胞呈多灶性或成片(P＜0.01)。凋亡细胞呈现核固缩、核破裂，或出现凋亡小体等。凋亡细胞最常见于肾小管。结论　观测细胞凋亡、UCHL1及BCL-2的表达可作为肾移植术后监测的重要指标。

The expression of BCL-2 and UCHL1 in renal allografts and clinical implication

CHEN Guangfu, LI Yantang, ZHAO Hailu, et al. Department of Urology, The General Hospital of PLA, Beijing 100853

　　【Abstract】　Objective　To study the relationship between apoptosis and rejection, expression of BCL-2 and UCHL1.Methods　The pathologic specimens of failed renal grafts from operation in 10 patients served as experimental group, and the corresponding biospy tissue before transplantation as control group. The expression of BCL-2 and UCHL1 in renal allografts was detected by using immunohistochemical staining technique in 6 cases of acute rejection, 3 cases of chronic rejection, and 1 case of cytomegalovirus infection. And the morphological changes were observed in the tissue sections.Results　In control group, the expression of BCL-2 in more than 50% tubules was positive, but significantly decreased in the experimental group (P＜0.01)，especially in acute rejection. T-lymphocytes expressing UCHL1 were significantly increased in renal allografts as compared with those in pretransplant specimens (P＜0.01). Under an electron microscope, apoptosis were demonstrated.Conclusion　The measurements of apoptosis, and the expression of BCL-2 and UCHL1 might play important role in the monitoring of renal allografts.

　　【Key words】　Transplantation　　Kidney　　Immunoassay　　Histocytochemistry

　　本研究根据我院肾移植临床资料，利用常规病理、免疫组织化学、电镜等技术，观察肾移植术前活检组织及手术切除的无功能移植肾细胞凋亡的形态学特征，以探讨细胞凋亡与排斥反应、BCL-2及UCHL1表达之间的关系。报告如下。

　　资料与方法

　　一、组织来源

　　收集我院切除的移植肾作为实验组，共10例，10例中6例为急性排斥，3例为慢性排斥，1例为巨细胞病毒(CMV)感染。其相应的移植术前活检组织作为对照组。对照组活检取材大小为0.3 cm×0.6 cm×0.3 cm。实验组分别从切除的移植肾上极、下极、中部、肾门等处取材，组织块大小约为1.0 cm×0.5 cm×0.3 cm，每例取6～13个(平均9个)组织块。活检组织用100 g/L的甲醛溶液固定，脱水，石蜡包埋，同时作HE染色和过碘酸雪夫氏染色(PAS染色)。

　　二、抗体的特异性

　　1. 抗UCHL1抗体(DAKO公司)为鼠抗人单克隆抗体，CD分类为CD45Ro，其相对分子质量为180×103，免疫抗原为白细胞介素2(IL-2)依赖性的T细胞系。该抗体主要特异性地标记活化的T淋巴细胞(包括CD8和CD4亚型)，而对B淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)和大部分单核巨噬细胞则呈阴性反应，工作浓度为1∶100。

　　2. 抗BCL-2抗体(DAKO公司)为兔源性多克隆抗体，抗原为滤泡性B细胞淋巴瘤的BCL-2基因产物，可特异地与BCL-2基因产物起免疫反应。只有可能发生凋亡的细胞才能为BCL-2抗体所标记，工作浓度为1∶50。

　　三、透射电镜技术

　　选择急性排斥反应和慢性排斥反应各2例作电镜观察。每例切取1 mm×1 mm×1 mm大小肾皮质组织6块，20 g/L～30 g/L的缓冲戊二醛液固定，脱水，包埋，半薄切片，超薄切片，染色。在日立牌H-7000及H-600型透射电镜下观察。

　　四、细胞凋亡分级

　　按每10个20倍物镜视野中凋亡细胞个数，分为4级：(1)正常(0)：凋亡细胞数＜2个；(2)轻度(+)：凋亡细胞数为2～5个；(3)中度(++)：凋亡细胞数为6～10个；(4)重度(+++)：凋亡细胞数＞10个。

　　五、免疫组织化学染色结果判定

　　免疫组织化学染色采用标记的链亲合素-生物素法(LSAB)，LSAB试剂盒为DAKO公司产品。

　　1. UCHL1表达(淋巴细胞半定量)：(1)正常(0)：肾间质内散在个别阳性细胞，一般少于4个/20倍视野；(2)+：弥漫或散在小灶阳性细胞，一般为5～20个/20倍视野；(3)++：多灶性阳性细胞；(4)+++：成片的阳性细胞。

　　2. BCL-2表达(抗凋亡基因蛋白表达半定量)：(1)+++：50%以上的肾小管细胞呈阳性表达；(2)++：25%～50%的肾小管细胞呈阳性表达；(3)+：25%以下的肾小管细胞呈阳性表达。

　　结　　果

　　一、移植肾细胞凋亡的光镜观察

　　1. 凋亡形态：核固缩，染色质边集，核碎裂，或出现凋亡小体；凋亡小体可呈半月形、船形、印戒样、马蹄形等多种形态。胞浆改变不明显，或胞浆固缩，嗜伊红性增多。

　　2. 凋亡细胞发生部位：依次为肾小管上皮细胞、炎性细胞、动脉壁平滑肌细胞、内皮细胞、肾小球系膜细胞、移行上皮细胞、肾小球Bowman囊上皮细胞。肾小管上皮细胞凋亡可与核分裂相伴出现，细胞核碎裂的细胞趋向腔面或脱落于管腔中，主要见于近曲小管和直小管，集合小管相对少见。炎性细胞凋亡主要为淋巴细胞和中性粒细胞，见于肾间质或小血管腔内，主要出现凋亡小体。浆细胞凋亡时胞浆红染、固缩，核碎片3～5个。其他类型细胞的凋亡主要表现为核碎裂。

　　二、免疫组织化学的染色结果

　　1. BCL-2的表达：BCL-2表达阳性的表现为胞浆及胞膜有棕黄色颗粒。按阳性程度排列阳性细胞顺序依次为：肾小管上皮细胞(近曲小管为著)、移行上皮细胞、肾小球系膜细胞和Bowman囊上皮细胞、血管内和间质中淋巴细胞。本组10例移植肾的细胞凋亡与BCL-2的表达见表1。经配对检验，移植前后移植肾的细胞凋亡及BCL-2表达的差异均有极显著意义(P＜0.01)，即移植肾的细胞凋亡明显增加，BCL-2表达却明显减少。

表1　10例移植肾的细胞凋亡与BCL-2表达

例号 诊断 细胞凋亡 BCL-2的表达
对照组 实验组 对照组 实验组
1 急性排斥 0 + +++ ++
2 慢性排斥 0 ++ +++ ++
3 急性排斥 0 +++ +++ ++
4 CMV感染 0 +++ +++ +
5 急性排斥 0 +++ +++ ++
6 慢性排斥 0 ++ +++ ++
7 急性排斥 0 +++ +++ +
8 慢性排斥 0 ++ +++ ++
9 急性排斥 0 +++ +++ ++
10 急性排斥 0 +++ +++ ++

　　2. UCHL1的表达：UCHL1表达阳性的表现为细胞膜及细胞浆有棕黄色颗粒。阳性T细胞形态：类圆形或圆形，胞浆很少，核呈脑回状，核染色质厚，核仁罕见，主要分布在肾小球、肾小管、小动脉壁内膜。UCHL1的表达见表2。经配对检验，这10例移植肾的UCHL1的表达与移植前比较差异有极显著意义(P＜0.01)，即移植肾的UCHL1阳性表达明显。

表2　10例移植肾及其对照组UCHL1阳性表达与细胞凋亡

编号 细胞凋亡 UCHL1阳性T细胞
对照组 实验组 对照组 实验组
1 0 + 0 ++
2 0 ++ 0 ++
3 0 +++ + +++
4 0 +++ 0 +++
5 0 +++ + +++
6 0 ++ + ++
7 0 +++ 0 +++
8 0 ++ 0 ++
9 0 +++ 0 +++
10 0 +++ + +++

　　三、透射电镜观察结果

　　1. 急性排斥反应：肾小球毛细血管内红细胞淤积，并可见单核细胞不规则，足细胞突起数量轻度减少；肾小管刷状缘减少或消失，肾小管细胞胞浆内溶酶体增多，可见淋巴细胞浸润。发现凋亡的肾小管上皮细胞和Bowman囊上皮细胞各一个。形态上表现为核碎裂成片，胞浆变得致密，细胞器(如线粒体、内质网、溶酶体)相对正常。

　　2. 慢性排斥反应：肾小球毛细血管基膜增厚、不规则，系膜区胶原增多，可见凋亡的系膜细胞，入球小动脉管壁增厚；肾小管刷状缘明显减少或缺失，可见凋亡的肾小管上皮细胞脱落于管腔中。小动脉内膜中平滑肌细胞增生，间质胶原显著增多，并可见淋巴细胞和浆细胞。

　　讨　　论

　　1972年Kerr等［1］详细描述了细胞正常死亡时的超微结构的变化，并首次命名为细胞凋亡。本研究表明，细胞凋亡是移植肾的病理学特征，切除的移植肾均有细胞凋亡现象，而正常供肾组织中细胞凋亡罕见。移植肾肾小管上皮细胞、炎性细胞、肾小球系膜细胞、移行上皮细胞以及血管固有细胞均可发生凋亡，尤以对缺血缺氧极为敏感的近曲小管常见和严重。近曲小管具有重要的吸收功能，普遍的肾小管上皮细胞凋亡，必将影响肾小管吸收功能。Schumer等［2］发现即使是5分钟的短暂缺血也会导致肾小管上皮细胞凋亡。研究结果表明，肾小管上皮细胞凋亡在移植肾急性肾功能不全中起了重要作用，移植肾的急性肾小管坏死是细胞凋亡的结局［3］。其它器官移植的研究也得出结论，即细胞凋亡是排斥反应中细胞死亡的主要方式，在移植器官功能衰竭中起重要作用［4］。Olsen等［5］应用光镜和电镜技术半定量地从形态上和发病机理方面研究了移植肾的原发性功能不全，发现移植肾并发症区别于固有肾病的形态特征为：前者肾小管上皮细胞凋亡严重，肾小管上皮细胞内肌动蛋白丝显著减少，肾小管内管型物质相对较少，肾间质大量炎性细胞浸润，并形成肾小管炎。因此，认为显著的细胞凋亡是移植肾并发症区别于固有肾病的重要形态学特征。

　　细胞凋亡受多种基因的调控，其中BCL-2基因是目前认为较肯定的抗凋亡基因。表达BCL-2基因的上皮细胞具有生存能力，而失去BCL-2基因表达能力的上皮细胞则注定要凋亡、坏死。本组资料显示，供肾活检组织中肾小管具备移植后生存能力。实验组BCL-2的表达明显减少，尤其是当发生急性排斥反应时，BCL-2的表达减少更为明显，表明肾小管上皮细胞受到了损伤，甚至发生了凋亡或其他类型细胞死亡。因此，BCL-2可作为判断移植肾预后的重要指标，失去BCL-2的表达，将预示着肾功能的降低或不全。

　　目前知道，细胞凋亡是由激素、细胞因子、基因、细胞介导的细胞毒作用等因素调节的。Shi等［6］的研究发现环孢素A可抑制T淋巴细胞活性使之发生细胞凋亡。另外，Labalatte等［7］的研究证实环孢素A通过调节BCL-2基因使细胞毒性T淋巴细胞的凋亡和增殖达到新的平衡。

　　正常供肾组织中仅有少量淋巴细胞，而移植肾组织中的T淋巴细胞数量显著增加，尤其是急性排斥时，肾小管炎、动脉内膜炎中浸润的主要细胞就是活化的T淋巴细胞。T淋巴细胞，尤其是CTL亚型是介导细胞凋亡的最重要细胞，CTL可以通过分泌转化生长因子β(TGF-β)、Grabzym B、TIA-1以及穿孔素等使细胞凋亡［8］。检测移植肾活检组织中的淋巴细胞、CTL细胞将成为诊断急性排斥反应的重要指标。

　　参考文献

　　[1]　Kerr JFR, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis:a basic biologic phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br J Cancer, 1972, 26:239-257.

　　[2]　Schumer M, Colombel, Sawczuk IS, et al. Morphologic, biochemical, and molecular fvidence of apoptosis during the reperfusion phase after brief periods of renal ischemia. Am J Pathol, 1992, 140:831-838.

　　[3]　Matsuno T, Nakagawa K, Sasaki H, et al. Apoptosis in acute tubular necrosis and acute renal allograft rejection. Transplant Proc, 1994, 26:2170-2173.

　　[4]　Krams SM, Egawa H, Quinn MB, et al. Apoptosis as a mechanism of cell death in liver allograft rejection. Transplantation, 1995, 59:621-625.

　　[5]　Olsen S, Buodick JF, Keown PA, et al. Primary acute renal failure(acute tubular necrosis) in the transplanted kidney: morphology and pathogenesis. Medicine, 1989, 68:173-187.

　　[6]　Shi Y, Sahai BM, Green DR. Cyclosporin A inhibits activation induced cell death in T-cell hybridomas and thymocytes. Nature, 1989，339:625-629.

　　[7]　Labalatte M, Queyrel V, Masy E, et al. Implication of cyclosporine in up-regulation of Bcl-2 expression and maintenance of CD8 lymphocytosis in cytomegalovirus-infected allograft recipients. Transplantation, 1995, 59:1714-1723.

　　[8]　Lipman ML, Stevens AC, Bleackley RC, et al. The strong correlation of cytotoxic T lymphocyte-specific serine protease gene transcripts with renal allograft rejection. Transplantation, 1992, 53:73-79.