肾移植术后舛ㄍ庵苎狢D3/HLA-DR及CD3/CD(16+56)的临床意义

　　【摘要】　目的　探讨肾移植患者术后外周血CD3/HLA-DR及CD3/CD(16+56)的变化及其意义。方法　提取患者的外周血淋巴细胞，加入双荧光标记的鼠抗人单克隆抗体CD3/CD(16+56)、CD3/HLA-DR，流式细胞分析仪进行测定。结果　术前患者的CD+3/CD+(16+56)、CD-3/CD+(16+56)及CD-3/HLA-DR+高于健康人，而CD+3/CD-(16+56)和CD+3/HLA-DR-低于健康人；术后3天肾功能稳定者的全部淋巴细胞亚群下降，尤以CD+3/CD+(16+56)为著；术后排斥者的CD-3/CD+(16+56)、CD+3/CD+(16+56)、CD-3/HLA-DR+及CD+3/HLA-DR+较稳定者显著升高，而急性肾小管坏死者的上述4个指标异常增高，是排斥组的2倍。结论　术后动态测定CD3/HLA-DR和CD3/CD(16+56)有助于急性排斥和急性肾小管坏死的早期诊断及鉴别诊断，对及时治疗和抗排斥疗效的评价具有一定意义。

Determination of CD3/HLA-DR and CD3/CD(16+56) in peripheral blood in the patients with kidney transplantation and its implication

LI Xiangtie, LI Shenqin, LIU Shaoge, et al. The Ji’nan Military General Hospital of PLA, Ji’nan 250031

　　【Abstract】　Objective　To investigate the changes in the activated T-cell populations CD3/HLA-DR and CD3/CD(16+56) in peripheral blood in the patients with kidney transplantation.Methods　The lymphocytes from the peripheral blood in the patients in different periods after kidney transplantation were immunologically labeled by dual color fluorescent monoclonal antibodies CD3/HLA-DR and CD3/CD(16+56). CD3/HLA-DR and CD3/CD(16+56) were determined by using flow cytometry (FCM).Results　The levels of CD+3/CD+(16+56)，CD-3/CD+(16+56) and CD-3/HLA-DR+ in the patients before renal transplantation were higher than in the normal subjects, while the CD+3/CD-(16+56) and CD+3/HLA-DR- were lower. Three days after transplantation, the T cells and T cell subsets were decreased in the getting-well patients, and the CD+3/CD+(16+56) were the most obvious among them. The levels of CD-3/CD+(16+56), CD+3/CD+(16+56) and CD-3/HLA-DR+ were significantly increased in the group with rejection. The four parameters mentioned above in patients with acute nephrotubal necrosis were all abnormally increased as two times as those of the group with rejection.Conclusion　The dynamic determination of CD3/HLA-DR and CD3/CD(16+56) is helpful to the early diagnosis and differential diagnosis of acute kidney rejection from acute nephrotubal necrosis, and is of some important for the treatment of rejections and the evaluation of the curative effects of antirejection.

　　【Key words】　Kidney/transplantation　　Lymphocyte　　Antibody, monoclonal

　　我院自1995年12月至1997年2月，应用流式细胞免疫学方法(FCMI)动态观察65例肾移植患者的外周血CD3/HLA-DR及CD3/CD(16+56)，发现其在手术前后、急性排斥及抗排斥治疗后、急性肾小管坏死时均有变化，报告如下。

　　资料与方法

　　一、一般资料

　　肾移植患者65例，男47例，女18例，年龄18～60岁，平均42岁，原发病为慢性肾炎、尿毒症。移植前均进行了时间不等的血液透析，均无活动性的免疫性和感染性疾病。供受者ABO血型相同，淋巴细胞毒交叉配合试验＜0.08。术后采用环孢素A(CsA) 8 mg·kg-1.d-1、硫唑嘌呤(Aza)50 mg/d及泼尼松(Pred)20 mg/d进行免疫抑制治疗。

　　二、方法

　　1. 特殊抗体：异硫氰酸荧光素(FITC)和R-藻红蛋白(PE)双荧光标记的鼠抗人单克隆抗体CD3-FITC和CD(16+56)-PE及双荧光标记的阴性对照单克隆抗鼠抗体IgG1-FITC/IgG1-PE均为法国国际免疫公司产品(批号96003)。淋巴细胞分离液为中国医学科学院血液学研究所出品(批号950608)。

　　2. 外周血淋巴细胞的提取：手术前日和术后3、7、14、21、28天分别抽取静脉血2 ml，用质量分数为2%乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝(1∶9)。加入淋巴细胞分离液2 ml，1 500 r/min离心5分钟，提取其中的淋巴细胞层，再以磷酸盐缓冲液(PBS)2 ml漂洗，同速离心2次，去上清液后以体积分数为70%的乙醇1 ml固定，4 ℃备用。

　　3. 免疫反应：反应前以PBS漂洗离心1次，1 500 r/min离心10分钟，以除去固定剂，再将每份悬液分为3管，其中一管加CD3-FITC/CD(16+56)-PE 20 ml室温下20分钟，2 000 r/min离心5分钟，除去上清液后再以PBS漂洗离心2次，2 000 r/min，每次5分钟。

　　4. 流式细胞分析仪及检测方法：FACScan型流式细胞分析仪由美国SD公司生产。检测方法：光源为488 nm的氩离子激光，FITC受激发后发出绿色荧光，上机荧光以标准微球调整仪器，使变异系数在2%以内。上机后收集2 000～50 000个细胞，荧光强度以对数放大，光反射数据存软盘，测试完后在Macintosh 650计算机上用Cell Quest Plot软件程序(美国BD公司生产)分析数据。

　　5. 细胞测定：同时计数外周血B细胞(CD-3/HLA-DR+)、自然杀伤细胞群［CD-3/CD+(16+56)］、活化T细胞［CD+3/CD+(16+56)，CD+3/HLA-DR+］、静止性T细胞［CD+3/CD-(16+56)，CD+3/HLA-DR-］。所有测定值均以均数±标准差(±s)表示，并以方差和t检验进行统计学分析。

　　结　　果

　　术前和术后稳定者的CD3/HLA-DR及CD3/CD(16+56)值见表1。术后稳定患者不同时间的CD3/CD(16+56)及CD3/HLA-DR值的变化见图1。

　　移植术后1个月内对稳定者、发生排斥者及发生急性肾功能衰竭者(ARF组)检测CD3/HLA-DR及CD3/CD(16+56)共计428次，结果见表2。

表1　肾移植前后CD3/CD(16+56)及CD3/HLA-DR水平(%)

组　别 例数 CD-3/

　　CD+(16+56)
 CD+3/

　　CD+(16+56)
 CD+3/

　　CD-(16+56)
 CD-3/

　　HLA-DR+
 CD+3/

　　HLA-DR+
 CD+3/

　　HLA-DR-
 
健康对照组 34 3.16±1.17 0.84±0.44 54.7±4.46 3.47±1.12 1.19±0.46 52.03±3.3
肾移植前　 65 4.01±1.85 3.86±1.08** 35.19±3.15 4.25±1.73 1.68±1.45 34.63±4.4
术后稳定组 54 2.89±1.13* 1.43±1.1* 37.48±5.58 2.59±1.05* 1.18±0.85 37.43±11.2

　　注：*与术前比较，P＜0.05；**与健康组比较，P＜0.01

表2　临床各组的CD3/CD(16+56)及CD3/HLA-DR水平(%)

组　别 例数 CD-3/

　　CD+(16+56)
 CD+3/

　　CD+(16+56)
 CD+3/

　　CD-(16+56)
 CD-3/

　　HLA-DR+
 CD+3/

　　HLA-DR+
 CD+3

　　/HLA-DR-
 
稳定组 54 2.89±1.13 1.43±1.1 37.48±5.58 2.59±1.05 1.18±0.85 37.43±11.2
排斥组 11 5.98±2.10* 6.97±2.3** 32.05±7.9 5.63±1.98* 7.87±1.11** 30.68±10.3
ARF组 5 11.83±5.25** 9.05±3.17** 28.32±11.3* 10.86±1.95** 11.92±2.23** 27.65±9.29

　　注：*与稳定组比较，P＜0.05；**与稳定组比较，P＜0.01讨　　论

　　CD3/HLA-DR属于HLA Ⅱ类抗原［1］，它主要分布在外周血B细胞、单核细胞及激活的T淋巴细胞上。在正常人肾内主要分布于间质树突状细胞、肾内皮细胞、毛细血管和肾小球细胞。移植后Ⅱ类抗原表达增加，γ-干扰素(IFNγ)也能诱导Ⅱ类抗原表达。CD3/CD(16+56)抗原表达主要在自然杀伤细胞(NK细胞)上，NK细胞群中有CD16、CD56、CD57，其中CD(16+56)占90%，其活性最强。CD16主要与NK细胞和中性粒细胞的IgG-FC受体反应，CD56主要与NK细胞、细胞毒T细胞亚群反应。

　　本研究发现术前患者的CD+3/CD+(16+56)、CD-3/CD+(16+56)及CD- 3/HLA-DR+高于健康人，而CD+3/CD-(16+56)和CD+3/HLA-DR-低于健康人，说明患者处于免疫功能紊乱状态。肾移植后稳定组的患者表现为全部淋巴细胞亚群下降至低水平。术后3天各值下降明显，尤以CD+3/CD+(16+56)为显著(P＜0.01)。7天后轻度增高，2周后继续下降，3周稳定于低水平。认为术后3天快速下降与使用大剂量甲泼尼龙有关，而2周后的继续降低与使用CsA、Aza等免疫抑制剂有关，提示为免疫抑制状态，因此移植肾受到保护。

　　在急性排斥反应时，外周血NK细胞、B细胞及活化T细胞显著升高(P＜0.01)，而静止性T细胞无明显变化，这种情况发生一般早于临床症状2～3天。使用甲泼尼龙冲击治疗2天左右NK细胞群、B细胞及活化T细胞下降，接近排斥前水平。本组11例发生排斥的患者中有2例经甲泼尼龙反复冲击治疗无下降，后移植肾功能丧失。

　　Malinowski等［2］报告肾移植患者在急性排斥时外周血的CD+8、CD+57细胞增高，而移植肾(RKT)组织内的CD+3/HLA-DR+和CD+8、CD+57细胞增高更显著，是外周血中的3～19倍。这些阳性细胞的持续增高提示预后不佳。

　　本组发生急性肾小管坏死5例，在肾功能恢复之前，其外周血B细胞、NK细胞、活性T淋巴细胞异常增高，是术后稳定患者的3～6倍，而静止T细胞降低，其机理尚不清楚，可能与肾小管坏死导致肾内间质树突状细胞、肾内皮细胞、肾小管细胞等抗原表达增加、细胞因子释放增加及IFNγ的诱导而激活NK细胞和活性T淋巴细胞有关。通过对CD3/CD(16+56)和CD3/HLA-DR动态观察，有助于急性排斥和急性肾小管坏死的早期诊断及鉴别诊断，对及时治疗和抗排斥疗效的评价有一定意义。

参考文献

　　[1]　宋强，宋素芹，赵川莉，等. 再生障碍性贫血患者外周血淋巴细胞HLA-DR抗原及CD57抗原的表达. 上海免疫学杂志，1995，15：285-293.

　　[2]　Malinowski K, Waitzer W C, Jao S, et al. Homing of CD8, CD57 T lymphocytes into acute rejected renal allografts. Transplantation, 1992, 54:1013-1017.