血液肿瘤树突状细胞的研究

　　 摘　要　树突状细胞（Dendritic Cells，DC）是目前体内功能最强的专职抗原呈递细胞，具有启动T细胞介导的免疫反应的功能。本文介绍DC在血液肿瘤中诱导的自身肿瘤杀伤活性、移植免疫、治疗及预后等方面的研究。

　　树突状细胞（Dendritic Cells,DC）是近年来倍受人们关注的专职抗原呈递细胞（Antigen presenting Cells,APC），能摄取、加工及呈递抗原，启动T细胞介导的免疫反应。DC于1973年首次由Steinman和Cohn发现。近年来关于DC分化、发育及抗肿瘤应用尤其受到人们的关注。本文对血液肿瘤DC的研究作一综述。

　　1 DC诱导的自身肿瘤杀伤活性

　　Choudhury等[1]报道，慢性髓系白血病（CML）慢性期患者外周血单个核细胞与细胞因子-粒单核细胞集落刺激因子（CM-CSF）、白介素4（IL-4）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）在体外共同孵育后，产生了形态学、免疫表型具有DC特征的细胞，荧光原位杂交（FISH）表明这些细胞中t（9；22）的存在，说明它们来自白血病细胞。特异的体外测定DC的功能证实这些细胞具有潜在刺激淋巴细胞增殖的作用。体外产生的白血病DC刺激自体T细胞产生了强烈的抗白血病细胞的细胞毒活性，但对主要组织相容性复合物（Major histocompatibility Complex,MHC）匹配的正常异体骨髓细胞表现为低反应。用DC刺激的自体T细胞抗CML靶细胞的细胞毒活性，是体外单用IL-2培养扩增的自体T细胞作用的4～6倍。DC刺激的T细胞也抑制CML克隆前体的生长。这些结果表明，体外细胞因子诱导CML细胞向DC分化，这些DC具有明显的T细胞刺激功能。体外产生的DC通过对白血病特异性抗原的有效传递产生抗白血病作用。Robinson等[2]报道，急性白血病（AL）细胞在上述细胞因子的作用下亦能向DC分化。作者用21例AL患者的外周血单个核细胞与GM-CSF、TNF-α共同孵育，15例细胞成活，其中12例可观察到符合DC典型的形态学特征。流式细胞分析显示，这些细胞有DC特异性抗原CD1a、CD83的表达，成熟DC还有HLA-DR、CD40、CD80、CD86的表达。9/12例中混合淋巴细胞反应（MLR）测定，这些培养的细胞具有很强的抗原呈递功能，经FISH分析证实，一些AML的DC起源于5q-及ph+白血病细胞，另外2例髓系和淋巴系双表型白血病CD19持续异常表达。AML恶性转变发生在多能干细胞水平，但是体内随后白血病细胞的分化被局限于某一细胞系、然而体外白血病克隆50%可自然向单核细胞、粒细胞成熟，另外在细胞因子的作用下可进一步终末细胞分化。该研究证实了AL原始细胞衍生的DC是恶性起源的，表明一种恶性细胞向具有潜在抗原呈递能力的细胞转变，这类细胞具有很强的呈递肿瘤相关抗原的能力，因此可以用于诱导抗白血病免疫反应。需指出的是，DC的白血病起源由以下证据支持：①在培养的外周血单个核细胞中白血病原始细胞占90%～98%，细胞数量在整个培养阶段维持稳定且具有恒定的高存活力；②在GM-CSF、TNF-α中培养后观察到的DC占73%～92%，比在相同条件下正常祖细胞衍生的DC比例高；③AL单个核细胞生成的DC与正常DC前体行为不一致。体外来自12/15例AL所产生的潜在抗原呈递DC，这一发现提出的两大重要问题有待于进一步研究：①一种早期干细胞表型是这种现象的先决条件吗？AL与其它白血病的进一步研究，需要确定是否如此，以及该现象的真正频率和生物学重要性；②这种体外成熟能允许假定的白血病相关抗原更有效地呈递到有适当受体的细胞毒T细胞吗？

　　Choudhury等[3]报道，AML包括一组血及骨髓中原始髓细胞克隆积累的疾病，恶性细胞表现为髓细胞分化的变异程度及与许多特征性的细胞遗传异常和基因重排有关，特殊的细胞遗传变化通常与特殊疾病表型和临床后果有关。正常多能造血干细胞与白血病克隆共存于骨髓。成功的抗白血病治疗后，骨髓正常造血干细胞的造血功能得以恢复，但大多数病例，缓解仅为暂时的。因此，对于大多数AML病人的治疗上的挑战就在于防止复发，以期达到长期缓解。为此，Choudhury等[3]开展了体外诱导AML细胞分化成DC的工作，并以此来刺激自体的抗白血病的T细胞反应。他们在体外用GM-CSF+IL-4联合TNF-α或CD40配体（CD40L）产生DC，对象19例不同染色体异常的AML病人，除1例外均产生了DC的形态学表型特征及T细胞刺激特性，这些细胞高表达MHC-Ⅰ类、Ⅱ类抗原及共刺激分子CD86和ICAM-1。有3例通过FISH分析染色体异常。自体淋巴细胞与AML衍生的DC共同培养能溶解自体白血病细胞，并注意到少许抗自体的正常细胞的细胞毒活性，这些正常细胞来自于病人缓解期。结果显示有DC表型、功能的细胞能从多数人AML标本中获得。如果已知AML的生物学异质性，就不会奇怪实验结果的变异及偶尔有AML细胞标本未显示有向DC分化。进一步研究这些细胞确保可决定靶抗原而进行被观察到的免疫活性。这些工作潜在治疗上的应用是重要的，白血病DC可潜在地被用作体内细胞的白血病疫苗或体外产生抗白血病的T细胞而用于免疫治疗。它们在免疫治疗上的应用于这种通常致死性疾病可消除微小残余疾病及将暂时的反应转变成持久缓解。

　　据Cao等[4]报道，GM-CSF可诱导鼠红白血病细胞（FBL-3）分化成类单核细胞的细胞来刺激宿主对白血病的免疫反应，即经GM-CSF处理后的FBL-3细胞，DC的特异性标志33D1及NLDC-145的表达阳性率显著升高，同时MHC-Ⅱ类分子，CD80、CD86的表达及血管细胞粘附分子1（VCAM-1）表达显著上调，通过电镜观察到DC典型的形态学。功能上，GM-CSF诱导的FBL-3细胞可明显刺激初始异基因的和自体的T细胞的增殖，并诱导特异的细胞毒T细胞的产生。总之，这些结果对白血病的免疫治疗有重要启示。

　　2 DC在移植免疫中的作用

　　Fujii等[5]提出，CD34+脐血细胞衍生的DC是可诱导抗肿瘤的细胞毒细胞，如细胞毒T细胞、NK细胞和单核细胞。用射线照射的MHC-Ⅰ类抗原阳性的K562细胞脉冲刺激的DC刺激脐血T细胞能选择诱发清除K562 mHC-Ⅰ类抗原，CD8+或MHC-Ⅰ抗原T细胞的这种杀伤活性几乎完全被抗体消除，而CD4+T细胞则不同。这表明CD34+脐血细胞衍生的肿瘤细胞脉冲的DC能诱导抗相应的肿瘤细胞的肿瘤特异性细胞毒T细胞，这些细胞毒T细胞是经MHC-Ⅰ类分子识别肿瘤细胞的CD8+T细胞。这个发现具有潜在的重要性，提示DC在脐血移植中及在临床免疫治疗的应用。

　　近来，脐血干细胞移植已被用于治疗致死的先天性或恶性疾病，且取得显著成功[6，7]。积累的实验及临床依据业已证明该临床措施的有效性。脐血移植无需严格的HLA相合，GVHD发生机会少，这可能归因于新生免疫系统的独特性，更能耐受异已抗原。许多研究提示体外各种不同的功能测定中脐血与成人血比较而言缺乏T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞及DC。Harris等[8，9]与其他学者[10，11]报道脐血T淋巴细胞表型及功能如此不成熟以至于异基因刺激后很少产生细胞毒T细胞活性。大量证据表明：造血干、祖细胞起源的DC可专门呈递抗原到初始T细胞，因此很有可能DC呈递抗原是脐血初始T细胞激活所必需。对于肿瘤治疗，研究者致力于将肿瘤抗原脉冲的DC用作治疗性的疫苗，同时也用于体外采用T细胞治疗中启动肿瘤抗原特异的T细胞[12，13]。据近来报道，肿瘤抗原负载的DC的免疫作用代表了诱导抗肿瘤免疫的有力措施[14，15]。本研究中，试图用CD34+脐血细胞衍生的DC，诱导抗肿瘤细胞毒性活性作为脐血移植后GVL效应的体外模型。

　　在不久的将来，脐血移植可能成为各种不同的致死性恶性肿瘤尤其血液肿瘤的标准治疗手段，因为它优于其它干细胞来源的移植。但在脐血移植中，GVL效应减少将成为一个问题。移植免疫治疗的一个目标是创造一种方法，即可避免GVHD、根除残余肿瘤免疫的策略，也可激活脐血单个核细胞抗未知抗原承载的肿瘤细胞。总之，在造血干细胞移植中，正确使用DC可能有益于更特异和更有效的免疫治疗。

　　外周血干细胞移植时，移植物DC可以直接激活宿主残存的T细胞，导致移植物排斥和移植失败。因此，去除移植细胞中DC，保留干细胞（CD34+HLA-DR-）的重建活性，将会提高移植的成功率[16]。同种异基因骨髓移植供者来源DC间接呈递受者次要组织抗原，是GVHD发生的主要途径[17]。此外，动物实验表明，骨髓去除性治疗只是去除了大部分，而不是全部的受者DC。

　　临床移植中控制DC策略[18]：DC是刺激T细胞免疫反应的专职APC，调控DC或干扰DC致敏途径，有可能延长移植存活并促进耐受。控制DC的可能策略包括：①去除DC即移植前预处理移植物达到减少或消除移植物内DC的目的，避免直接致敏从而延长移植物存活；②抑制DC移行或成熟，通过进一步研究DC移行机制，选择调节DC移行和成熟的某种因子，有可能阻断致敏途径；③阻断DC与T淋巴细胞共刺激信号，如用CTLA-4-Ig阻断B7/BB1和CD28间作用有可能诱导耐受；④DC耐受作用，耐受与嵌合现象的发现，使人们重新认识DC在移植中作用，随着对DC研究的深入，人们有希望筛选出某一类型DC，用于诱导移植嵌合体形成。

　　3 DC治疗肿瘤

　　DC的研究近年来已成为肿瘤治疗研究的热点，其分化发育及抗肿瘤应用尤其受到人们关注。动物实验表明应用多种形式的肿瘤抗原体外冲击致敏DC，少量回输即可诱导机体产生极强的抗肿瘤免疫[19]。DC的临床试用亦有报道，DC回输疗法已试用于非霍奇金B细胞淋巴瘤、黑色素瘤、前列腺癌、多发性骨髓瘤（MM）晚期患者的治疗。对于非霍奇金B细胞淋巴瘤的治疗，是应用抗独特型抗体体外致敏的自体DC，目前已取得良好的临床疗效[15]。德国学者[20]应用独特型蛋白多肽体外致敏的自体DC回输治疗了7例MM患者。其作法是从MM患者血清中分离出独特型蛋白，酶消化降解后用HPLC纯化出多肽，然后用此多肽体外致敏CD34+细胞来源的自体DC，将此类DC给MM患者皮下注射，并随后每隔2周皮下注射一次独特型蛋白多肽，连续3次，结果发现在受检查的4例MM患者中，有2例血中抗独特型IgM和IgG抗体的水平分别升高约8倍和12倍，而且还观察到独特型蛋白的特异性T细胞免疫反应，表明该疗法的有效性和临床应用前景。

　　近来有关DC用于白血病治疗研究的报道较多，鉴于未成熟DC具有一定的吞噬能力，Fujii等[21]报道，为了用DC在体外诱导出自体细胞毒T细胞然后用于白血病的免疫治疗，将G-CSF动员的外周血CD34+细胞用GM-CSF和TNF-α体外培养出DC，这种DC混合群体（包括典型的成熟DC及未成熟DC）能摄取外源性蛋白抗原——钥孔戚血蓝素（Keyhold limpet Hemocyanin,KLH）并将之提呈给CD4+和CD8+T细胞，诱导出KLH特异性细胞毒T细胞。并且他们选择3例AML患者，将放射性灭活的白血病细胞与DC、T细胞共同孵育后，结果其中2例诱导出能杀伤白血病细胞的自体细胞毒T细胞，从而为细胞毒T细胞过继免疫治疗奠定基础。

　　4 DC判断预后

　　有关这方面的研究报道较少。Baur等[22]报道了滤泡型树突状细胞（FDC）在结节硬化型霍奇金病（NSHD）中的预后价值。霍奇金病Rye分类中已建立的形态学表型、组织学显示一个宽阔的范围，然而这种组织学不同并未被考虑作为预后因素。NSHD病理组织学分级中两个亚型NSⅠ（恶性）及NSⅡ（高度恶性）的预后相关性仍然存在着争议，FDC的分析可提供新的预后参数。对59例NSHD进行研究，平均随访时间8年，按分类41例为NSⅠ，18例为NSⅡ。用耐石蜡的单克隆抗体CD21和CNA42免疫染色FDC，在肿瘤组织中区分出三种形式：FDC1，存在着广义的滤泡样结构（n=20）；FDC2，存在大量被破坏的FDC网状结构（n=25）；FDC3，无或少许孤立的FDC（n=14）。这3组根据复发频率及生存明显不同，发现生存最长的是FDC1组，最短在FDC3组，FDC2组居中（P=0.0025）。FDC状态是一个区别针对所有病人包括不同年龄和分期的预后因素。结合FDC状态和NSⅠ-NSⅡ分级将最佳生存组定义为FDC1-NSⅠ，对于NSHD的传统病理组织学检查，FDC的分析是一种新的预后判断方法。结果表明FDC状态的评估更加准确，其真正的预后价值有待于进一步的随机临床试验应用中加以评估。

　　对于DC的研究正受到人们的青睐。仍有许多问题尚未解决，如：如何调控DC的功能，使其选择性发挥作用。DC用于肿瘤免疫治疗大多仍处于实验研究阶段，但随着研究的深入，人们对DC分化调控及DC活化机制的掌握，DC在肿瘤免疫治疗中将会成为一种很有效的手段，具有广阔的前景而得到广泛的临床应用。

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