化脓性脑膜炎的诊断进展

　　化脓性脑膜炎（化脑）一直是危害人类健康的常见感染性疾病，尽管免疫预防和抗感染药物的广泛应用降低了发病率，但由于起病急，进展快，仍具有较高的病死率和后遗症发生率。常见致病菌仍以脑膜炎球菌、流感杆菌和肺炎球菌为主。近年来抗生素的发展为各种脑膜炎的治疗提供了更多的选择，但抗菌药物的选用仍须根据致病菌的种类及药敏而异。研究表明，化脑的预后与早期诊断和及时治疗密切相关，因此，早期、快速诊断对于指导治疗、改善预后极为重要。传统的确诊方法是通过直接涂片和细菌培养，但敏感性较低，特别是曾接受过抗菌药物治疗的患者，阳性率更低，而且细菌培养需要较长的时间，不利于及时治疗。随着免疫学技术的发展及推广应用，酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）乳胶凝集试验（latex agglutination test,LAT）等方法使化脑诊断的敏感性和特异性大大提高。近年来分子生物学飞速发展，核酸杂交技术与基因扩增技术的应用，为化脑的诊断提供了更为敏感和特异的检测手段。现将以上几种方法的研究进展概述如下。

　　LAT

　　在现有的免疫学检测方法中，LAT仍是一种较为常用的方法。其原理为利用已知抗体与相应细菌抗原结合，产生肉眼可见的凝集反应，方法敏感、特异且不受预先抗菌药物治疗的影响[1]，自70年代中期应用于微生物检测以来，在临床上已广泛应用。

　　Landgraf等[2]对80例化脑患者的脑脊液标本检测脑膜炎球菌、流感杆菌、肺炎球菌的抗原，发现LAT的特异性与敏感性均高于革兰染色涂片、脑脊液培养和对流免疫电泳法，特别是检测脑膜炎球菌有更高的敏感性。Camargos等[3]对299例儿童脑膜炎患者进行研究，以脑脊液培养为黄金标准，检测以上3种常见致病菌，其敏感度与特异度分别为93%和100%，结合临床流行病学资料，对于估计阳性预测值，进而作出早期诊断具有重要意义。而且若临床上不能得到脑脊液标本时，该法可以用于血或尿标本的检测。

　　但遗憾的是目前的标准的LAT法有几个缺点：若脑脊液中仅有少量病原菌时可致假阴性，而应用于血或尿标本检测时，敏感性、特异性均明显降低，因此急需提高这一检测系统敏感性的方法。1994年，Coakley等[4]研究发现抗体包被的粒子暴露于物理引力场（如超声波、交流电场）时，可大大提高其凝集作用，超声波可以使LAT的敏感性提高16~64倍，在检测尿标本时，可以将尿标本浓缩，从而使敏感性提高128~256倍（8~16倍来自浓集作用，16倍来自超声增强作用），而且可以缩短时间[5]，从而为LAT法检测化脑开拓了新的应用前景。

　　ELISA

　　ELISA是从酶标抗体技术发展起来的一种免疫学方法，综合了免疫荧光法放射免疫测定法两种技术的优点，不仅标记物稳定、判断客观、标本可以长期保存，而且敏感性、特异性均较高，比传统的涂片法和细菌培养有了巨大的进步。

　　ELISA等[6]用增强的化学发光-ELISA法检测脑脊液中李斯特菌特异性抗原，具有较高的敏感性和特异性。Salih等[7]用于检测脑膜炎球菌、流感杆菌和肺炎球菌所致化脑患者脑脊液的抗原，结果显示敏感性86%，特异性96%，而协同凝集法的敏感性仅69%，并且对两份流感杆菌脑膜炎患者的脑脊液标本稀释后再检测，结果证明ELISA法比协同凝集法敏感性高16~32倍。对使用过抗菌药物的患者，ELISA法全部阳性，而培养法仅55%阳性。最近，Salih等[8]又对125例儿童脑膜炎患者的脑脊液作分析，ELISA法的敏感性为100%，细菌培养法仅33.9%，直接涂片法30.4%。而且ELISA法所需时间不足1小时，结果可用肉眼观察，对于使用过抗菌药物的患者，优点更为明显。

　　斑点-酶联免疫吸附法（Dot-ELISA）是在ELISA法的基础上发展起来的一种更为微量、敏感的方法，所用试剂量少，价廉简便，避免了印迹法中电泳与转印等繁琐过程。Alkmin等[9]采用Dot-ELISAi法对585份脑脊液标本检测脑膜炎球菌多糖抗原，敏感性99.1%，特异性82.6%，比普通的LAT更优越，检测结果与细菌学方法一致，而且无需特殊设备，便于在基层实验室推广应用。

　　探针杂交技术

　　探针杂交技术是将标本与已知的标记核酸杂交，检测标本中有无与之互补的目的核酸，据此可测出pg水平的核酸，与临床常用的细菌培养及免疫学方法相比，该技术具有更好的敏感性和特异性，而且重复性好，能一次检测大量标本。Knight等[10]曾用含有2kb大小脑膜炎球菌DNA可重复序列的PUS210 DNA探针对英国1984~1989年脑膜炎球菌暴发流行菌株进行鉴定，结果不仅可以敏感地测出致病菌，而且结合限制性酶切片段长度多肽分析法（RFLP），可以对脑膜炎球菌进行菌株分型。由于同位素探针半衰期短，有放射性污染，又尝试了用非同位素标记的探针，但由于样本抽提DNA复杂，杂交分子数量太少，敏感性还不够高，因此目前单独使用核酸杂交技术来检测化脑的报道不多，常与聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）技术联合应用。

　　PCR-探针杂交技术

　　PCR技术是80年代后分子生物学领域中最重要的进展之一，通过变性、退火和引物延伸循环，DNA扩增倍数可达109~1010，再通过Southern印迹探针杂交法可以检出0.01pg样本中病原菌的特异性片段。1991年，Kristiansen等[11]根据脑膜炎球菌的二氢蝶呤合成酶（dhps）的基因序列，设计了两组引物，扩增出一段大小为0.95kb的DNA片段，再用特异性探针检测，首次成功地诊断出1例脑脊液培养阴性的脑膜炎球菌性脑膜炎。以后PCR-探针杂交技术被用于检测肺炎球菌、流感杆菌和李斯特菌所致的化脑，均取得了很高的敏感性和特异性[12~14]。随后在PCR的基础上，Jaton[14]用套式PCR（nested pCR）检测李斯特菌所致化脑，Caugant等[15]采用半套式PCR（seminested pCR）检测脑膜炎球菌所致化脑，敏感性、特异性均明显高于脑脊液培养法，为化脑的诊断提供了更为可靠的依据。

　　但是化脑的病原菌除常见的脑膜炎球菌、流感杆菌和肺炎球菌外，尚有大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌等致病菌，若不能及时诊治，病死率更高，但是用PCR-探针法分别检测以上细菌，将使这一方法繁琐、昂贵，为此，根据16S rRNA兼具保守性与特异性的特点，设计出通用引物与特异性探针。16S rRNA存在于所有细菌的染色体基因组中，具有高度的保守性，据此设计所有细菌的共同引物，可判断细菌的存在与否，在保守区之间又存在着9~10个变异区，不同菌种之间有明显的差异性，因而又有高度的特异性，据此设计特异性引物和探针，可对细菌作出分类鉴定，所以16S rRNA既可作为细菌与其它病原菌相鉴别的标志，又可作为不同细菌之间加以区别的标志。

　　Greisen等[16]根据16S rRNA的保守性设计了两对通用引物（DG74、RW01和DG74、RDR080），经PCR扩增后，又设计了3组探针，第1组是根据16S rRNA的保守性对革兰氏阳性（G+）和革兰氏阴性（G-）细菌设计的通用探针，第2组是利用16S rRNA的特异性分别对7种常见化脑致病菌设计的特异性探针，包括脑膜炎球菌、流感杆菌、肺炎杆菌、无乳链球菌、大肠杆菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌，第3组是用于检测常见的污染菌（如芽胞杆菌、凝固酶阴性的葡萄球菌、丙酸杆菌等）。结果不仅可以判断细菌存在与否，而且可以区分革兰阳性和革兰阴性细菌，并能准确地检出常见的7种细菌。因此对于常见菌可用特异性探针直接测出，对于少见菌可用革兰阳性或革兰阴性细菌探针得到初步的病原菌分类，以针对性地治疗。Radstrom等[17]进一步对这一方法验证，检测304份脑脊液标本，其中125例为脑膜炎球菌、流感杆菌和肺炎球菌所致化脑，显示敏感性达94%，特异性96%，从脑膜炎患者的脑脊液中最低可检出300 cfu的脑膜炎球菌。但该方法也有其局限性：①对任何细菌的核酸片段均可扩增，易出现假阳性。②所用同位素探针有放射性，难以在临床上推广应用，因此这一方法也需进一步完善。

　　近年来，人们又致力于PCR-ELISA方法的研究，从而避免了凝胶电泳和同位素探针的使用，方法更为简便、灵敏。Newcombe等[18]用PCR-ELISA法检测80份脑膜炎球菌所致化脑患者的外周血标本，敏感性、特异性均为100%，最敏感时可测出血清中30~45 cfu/ml的致病菌，比PCR-探针检测法更快速和准确。

　　小结

　　综上所述，随着免疫学与分子生物学的发展，化脑的诊断已不再局限于传统的检测方法。在敏感性、特异性上均有了明显的提高，特别是PCR-探针杂交技术的推广应用，使化脑的早期、准确诊断成为可能，从而可以及早治疗，有望降低化脑的病死率和后遗症发生率。