微波烘疗对原发性淋巴水肿免疫细胞的影响

www.cnkang.com 2007-3-24 8:37:00 中华康网

　　【摘要】　目的　探明原发性淋巴水肿患者免疫细胞之变化情况。方法　采用ABC及APAAP法免疫组织化学技术，分别对10例原发性下肢淋巴水肿患者患肢皮肤及外周血中淋巴细胞等进行分类分析，并观察微波烘疗的影响。结果　外周血CD8+T淋巴细胞增加、CD4+T淋巴细胞降低，CD4/CD8降低；局部皮肤真皮层小血管、毛细血管周围可见显著的呈灶性分布的单个核细胞浸润，以T淋巴细胞和单核巨噬细胞为主。结论　微波烘疗后可提高外周血中CD4+T淋巴细胞、降低CD8+T淋巴细胞，恢复CD4/CD8比值，因而可调节存在的免疫紊乱状态；对局部组织可显著降低T淋巴细胞浸润，提高巨噬细胞活性，增强其吞噬能力。认为微波烘疗通过其热效应及复杂的生物学效应，纠正原发性淋巴水肿患者全身免疫紊乱状态，促进局部组织炎症反应消褪及增强巨噬细胞吞噬作用，从而达到消除水肿、减轻角质细胞增生及纤维化形成的作用。

Effects of microwave baking on the immunological cells in pri mary lymphedema patients

CAO Weigang, ZHANG Disheng, GAN Jiliang.

　　depar tment of Plastic and Reconstructive Surgery,the Ninth People's hospital,Shanghai 200011

　　【Abstract】　Objective　To elucidate the effects of microwave o n the immunological cells in primary lymphedema.Methods　The imm unological cells including lymphocytes in the affected limb skin and peripheral blood of 10 patients with primary lower limb lymphedema were analysed using ABC and APAAP immunohistochemical methods before and after microwave baking and band aging treatment.Results　It is demonstrated that in the peripher al blood of the patients there was an increase of CD8+T lymphocytes as well as a decrease of CD4+T lymphocytes and the ratio of CD4/CD8.It was found that th ere was significant perivascular infiltration of mononuclear cells (most were mo nocytes and macrophages)in the skin of the affected limb.Conclusion　Microwave modulates the systemic immunological imbalance by its heating and complex biological effects on primary lymphedema patients through reversing the ratio of CD4/CD8 to normal level by increasing CD4+T lymphocytes and decreasing CD8+T lymphocytes.It can also decrease the perivascular T-lymphocyte infiltration of the affected dermis and enhance the phagocytic capabilities by promoting the proteolytic activities of macrophages, finally resulting in edema resolution.

　　【Key words】　Lymphedema　　Microwave　　Immunohistochemistry

　　肢体慢性淋巴水肿是一种严重影响患者身心健康的常见病，可由多种先天及后天性原因引起，其共同特点为高蛋白性水肿。原发性淋巴水肿根据起病时间不同可分为先天性、早发型、迟发型三种。由于其淋巴管常常发育不良，无法行淋巴管吻合手术，因此一些疗效较佳的重建淋巴回流的手术如淋巴管移植及浅、深淋巴管吻合等常常无法进行［1，2］。远红外线烘绑及其改进型微波烘疗对肢体慢性淋巴水肿取得了较好的疗效［3，4］，但其进一步的作用机理尚需阐明。近年来的一系列研究表明，免疫反应卷入了丝虫性淋巴水肿的发生及发展过程，全身及局部皮肤均有显著的免疫应答变化［5-8］，但原发性淋巴水肿患者是否有相应的变化尚未作单独研究。我们试图通过应用免疫组织化学技术分析原发性淋巴水肿患者全身及局部皮肤中免疫细胞比例及分布特点及微波烘疗的影响，阐明微波烘疗在调节原发性淋巴水肿患者全身及局部免疫反应中的作用，从免疫学方面阐明微波烘疗的作用机理。

　　1　材料与方法

　　1.1　临床资料

　　本组共10例，其中男性3例，女性7例。年龄7～69岁，平均24.6岁。均为原发性淋巴水肿患者，3例为双下肢，7例为单侧下肢。10例中先天性水肿3例，早发型水肿6例，迟发型水肿1例，病程2～40年。4例伴有反复发作之“流火”。

　　1.2　治疗方法

　　均采用微波烘绑疗法，微波治疗机工作频率2540 MHz，每天1次，每次2h,每周治疗5天，2周为1疗程，连续行两疗程共4周，在治疗期间，病人坚持白天使用弹性绷带。

　　1.3　外周血淋巴细胞分类检测

　　治疗前后各抽取静脉血1.5 ml，肝素(25μ/ml)抗凝，PBS.稀释后沿管壁加入到含3 ml淋巴细胞分离液的试管上层，离心分离得到单个核细胞，洗涤后离心得到淋巴细胞沉淀，去上清，留少许液体制成淋巴细胞悬液，滴于涂有粘片剂的玻片上，吹干后纯丙酮固定3min。APAAP试剂盒由北京军事医学科学院生物制剂发展中心提供，按试剂盒说明分别检查CD3、CD4、CD8、CD19比例，高倍镜下计数400个有核细胞，细胞膜或胞浆中有明显红染者为阳性细胞。

　　1.4　皮肤组织中浸润细胞分类

　　治疗前后分别在患肢内踝上方相近部位切取全层皮肤及皮下组织约2cm×1cm,一分为二，一半立即以O.C.T包埋，-20℃冰冻切片；另一半10%福尔马林固定，HE染色。ABC法测定组织中浸润细胞类型及比例，所用单抗为UCHL-1(CD45R)、CD4、CD8、L-26(CD20)和KP-1(CD68)，单抗及ABC试剂盒均由Dako公司提供(表1)。

表1　所用单克隆抗体

　　Tab1　Monoclonal antibodies used for ident ification

　　of cell phenotypes

标志物抗体结合特异性
CD3 T细胞
CD4 辅助/诱导T细胞
CD8 抑制/细胞毒T细胞
CD19 B细胞
CD20 B细胞
CD45R T细胞
CD68 人单核吞噬细胞、巨噬细胞

　　1.5　肢体周径测量

　　选取足中部、踝关节平面、踝上10cm处、膝关节及膝关节上10cm处为测量部位，计算出5处周径总和。单侧水肿患者以健侧为对照，分别得出治疗前后双下肢周径差，双侧水肿患者直接将治疗前后周径和作对比。2　结果

　　2.1　肢体周径变化

　　经微波治疗后患肢周径均减少，烘疗前平均周径差为23.04 cm，烘疗后为13.51 cm，治疗后周径和平均缩小为10.47 cm，经配对t检验，P＜0.01。提示微波烘疗后患肢周径显著缩小。

　　2.2　外周血T、B淋巴细胞及T淋巴细胞亚群改变

　　T总淋巴细胞(CD3)及B淋巴细胞同正常相比无差异，治疗前有CD4T淋巴细胞降低及CD8T淋巴细胞升高、CD4/CD8比值降低，同正常对照组相比P＜0.01，证明患者存在全身性的免疫紊乱状态；经治疗后，CD4T淋巴细胞上升、CD8T淋巴细胞降低、CD4/CD8比例接近正常，经配对t检验，P＜0.01，证明微波烘疗可纠正淋巴水肿患者的全身免疫紊乱状态(表2)。

表2　外周血微波治疗前后淋巴细胞变化(%)

　　Tab 2　Changes of lymphocytes and th e ratio of CD4/CD8 in peripheral blood before and after microwave treatment(%)

标志物 CD3 CD4 CD8 CD19 CD4/CD8
治疗前 69.3±7.7 34.2±6.4* 33.3±6.2* 12.7±4.8 1.03±0.36*
治疗后 68.4±8.3 41.4±7.2★ 24.6±4.8★ 13.5±5.1 1.53±0.44★
正常 67.3±7.5 43.1±8.3 25.3±5.3 12.4±5.3 1.72±0.48

患者组治疗前与正常相比：*P＜0.01，患者组治疗后与治疗前相比：★P＜0.01

　　2.3　局部组织改变

　　2.3.1　HE染色观察

　　微波烘疗前可见表皮角质层增厚，角质细胞明显增生向真皮浅层形成许多柱状突起，真皮层胶原沉积，纤维组织增生。表皮下真皮浅层可见显著的单个核细胞浸润，呈现小血管、毛细血管周围灶性分布之特点；真皮深层亦可见小血管增生反应，但周围浸润细胞较少。部分病例毛细血管内可见大量的中性核细胞聚集，另部分病例可见浆细胞存在。真皮层内尚常见有许多扩大的毛细淋巴管，内衬有单层扁平内皮细胞。微波烘疗后，表皮角质层变薄，表皮角质细胞增生减少，层数降低；真皮内小血管周围单个核细胞浸润明显降低，扩张淋巴管少见。

　　2.3.2　免疫组织化学分析

　　免疫组织化学染色观察显示真皮层小血管周围灶性单个核细胞浸润以T淋巴细胞为主，巨噬细胞常呈组织间散在分布，除1例有局灶性B淋巴细胞浸润外，余未见有B淋巴细胞存在。T淋巴细胞亚群分析显示CD8+T淋巴细胞较CD4+T淋巴细胞为多，烘疗后T淋巴细胞浸润明显降低，巨噬细胞数量增加，且活性增强，细胞内吞噬颗粒较治疗前显著增加(表3)。

表3　烘疗前后真皮层浸润细胞改变(每100血管周围浸润细胞)

　　Tab 3　Changes of dermal infiltratin g cells before and after

　　microwave treatment (per 100 perivascular cells)

标志物 UCHL-1 CD68 CD4 CD8 CD20
治疗前 52 25 24 35 少见
治疗后 30 30 14 18 少见

　　3　讨论

　　肢体慢性淋巴水肿时全身和局部组织的细胞、体液免疫改变是极其复杂多变的。一系列研究表明，患者外周血常有细胞免疫调节的紊乱，常有T淋巴细胞亚群的失衡，表现为 cD4+T淋巴细胞的降低或活化CD8+T淋巴细胞比例提高和CD4/CD8比例降低［5，6］，同时外周血中循环的可溶性CD8分子亦有升高［9］。本组病例中发现了类似的改变，提示原发性淋巴水肿时亦有细胞免疫紊乱存在的可能。引发这种免疫紊乱的原因可能同患者病程较长(本组平均为17年)、皮肤有反复的急性炎症及无临床表现的慢性炎症反应存在有关［10］。患者病变组织局部有特异性的血管周围T总淋巴细胞及CD4、CD8 t淋巴细胞亚群浸润，这同丝虫性淋巴水肿病理改变有类似之处［6，7］，且CD8T淋巴细胞浸润的增多可导致局部损伤性细胞因子的产生增加，从而进一步加重组织损伤，吸引更多的免疫细胞浸润，形成恶性循环，一系列细胞因子的释放最终形成了过度增生反应［11］，淋巴水肿时过度角质增生、疣状改变及纤维化的形成等可能同局部有较多的CD8+T淋巴细胞浸润有关。微波烘疗由于能有效减轻真皮层血管周围淋巴细胞浸润，缓解了局部炎症反应，因而打断了局部细胞浸润-细胞因子分泌-损伤-再浸润这个恶性循环，在逆转淋巴水肿病程发展方面有重要意义；同时微波烘疗能增加巨噬细胞数量和活性，促进其吞噬清除水肿组织中的蛋白质，因而对淋巴水肿的缓解亦起到了十分重要的作用。而微波烘疗通过何种机理调节失衡的免疫细胞及其从外周血循环向局部组织的迁徙则尚需作进一步的研究。参考文献

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