烧伤病人痂下水肿液对内皮细胞的损伤作用

www.cnkang.com 2007-3-24 8:39:00 中华康网

　　【摘要】　目的　了解痂下水肿液(Subeschar tissue fluid,STF)对内皮细胞的损伤作用，进一步论证STF是烧伤后一“贮毒库”的概念。方法　取烧伤病人痂下水肿液，按20%比例与体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)培养1，12，24h ，测定培养液中乳酸脱氢酶(LDH)和6-keto-PGF1α，观察内皮细胞活力和形态改变，并用健康人血清作对照。结果　STF与HUVEC一同孵育后培养液中LDH活性和6-keto-PGF1α含量逐渐升高，并明显高于健康人血清对照组(P＜0.01)，且 STF与HUVEC共同孵育24h，内皮细胞活力下降，内皮细胞出现收缩，细胞间间隙增大，部分细胞脱落和坏死，而健康人血清未能引起内皮细胞功能和形态改变。结论　STF可损伤内皮细胞，在烧伤后内皮细胞的损伤中起重要作用。

Endothelial cell damage induced in vitro by subeschar tissue fluid

LI Zhiqing, ZHOU Yipin, RONG Xinzhou, et al.

　　Burn Unit,Nanfang Hos pital,The First Military Medical University,Guanzhou 510515

　　【Abstract】　Objective　To assess the effect of subeschar tissu e fluid (STF) on the function and structure of endothelial cell in vitro.Methods　Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were incubated with STF obtained from patients in the early postburn stage. Then the morphol ogical changes in EC were observed,and activity of EC and contents of LDH,6-keto-PGF 1α in media were determined.Results　The activity of LDH and the cont ent of 6-keto-PGF1α were increased gradually after HUVEC incubated with STF,and were higher than that measured after HUVEC incubated with healthy volun teer′s sera.Furthermore,activity of HUVEC decreased and they became deformed,sh owing shrinkage of the cell body with enlargement of intercellular space.In addi tion,small vacuoles appeared in cytoplasm with karyopyoknosis after 24h. Conclusion　STF can damage endothelial cell and might play an important role in the pathophysiological process of burn injury.

　　【Key words】　Burn Endothelial cell Subeschar tissue fluid

　　严重大面积深度烧伤后，机体可迅速产生大量痂下水肿液(STF)，而STF在烧伤后机体病理生理改变过程中作用报道甚少，我们采用体外细胞培养方法，研究了STF对内皮细胞的影响，以探讨STF的毒性作用，为临床早期大面积切痂植皮有利于减轻和预防并发症提供理论依据。

　　1　材料和方法

　　1.1　人脐静脉内皮细胞(HUVEC)培养　按安静等方法进行［1］。将HUVEC以2 ×105/ml密度接种于6孔培养板或96孔板内，待细胞融合后使用。

　　1.2　痂下水肿液收集及实验分组　烧伤病人20例，其中男性17例，女性3例，年龄5～50岁，深Ⅱ度及Ⅲ度烧伤面积10%～60% TBSA。于伤后2～4天用无菌注射器从痂下组织间隙中抽取或手术中收集STF，-20℃保存。另取10例健康人外周血血清作对照。将健康人血清或STF 与1640培养液按20%比例混合，取2ml加入HUVEC生长良好的培养板中。实验分健康人血清组和STF组。

　　1.3　检测指标与方法

　　1.3.1　培养液中LDH测定　常规生化法。

　　1.3.2　培养液中6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)测定　放射免疫法，按解放军第三○一医院药盒说明书操作。

　　1.3.3　内皮细胞活力测定［2］　采用噻唑蓝比色法，培养于96孔板内的内皮细胞融合后与健康人血清或STF一同孵育24h后弃培养液加入噻唑蓝(Fluka产品，5mg/ml)PBS, 每孔20μl，37℃孵育4h显微镜下可见黑色结晶形成，加入二甲基亚砜100ml，振荡至结晶溶解，避光10min，酶标仪570nm波长计吸光度值(A)。

　　1.3.4　细胞形态观察　相差显微镜下动态观察加入STF和健康人血清后HUVEC形态变化和细胞脱落数，并行伊红考马斯亮兰染色，光镜下摄片。

　　1.4　统计学处理　结果以均值±标准差(x±s)表示，组间数据比例采用两样本均数t检验。

　　2　结果

　　2.1　培养液中LDH活性STF与内皮细胞孵育12h后，培养液中LDH活性明显增加，24h后进一步升高，较健康人血清组显著升高(P＜0.01)。而健康人血清与HUVEC共同孵育24h，培养液中LDH无明显变化(表1)。

表1　培养液中LDH活性(IU/L)变化

　　Tab1 Change of LDH activity in media after

　　HUVEC incubated with STF

组　别孵育时间(h)
1 12 24
健康人血清 3.00±0.83
4.37±1.52
5.65±1.83

痂下水肿液 12.15±2.65* 19.61±5.27* 26.42±6.37*

与健康人血清组比较：*P＜0.01

　　2.2　培养液中6-keto-PGF1α含量STF与HUVEC共同孵育24h，6-keto-PGF1α含量逐渐升高，且较健康人血清对照组也明显增高(P＜0.01)，而健康人血清与HUVE C孵育后，培养液中6-keto-PGF1α增高不明显(表2)。

表2　培养液中6-keto-PGF1α含量(pg/ml)变化

　　Tab2 Change of content of 6-keto-PGF1α in media after

　　HUVEC incubated with STF

组　别孵育时间(h)
1 12 24
健康人血清 755.62±93.57 868.72±03.52 1035.46±152.75
痂下水肿液 1876.19±103.44* 2813.69±474.65* 3328.63± 821.04*

与健康人血清组比较：*P＜0.01

　　2.3　STF对内皮细胞活力的影响　生长呈融合状的HUVEC用1640培养液换液，继续培养24h 时，细胞活力是0.753±0.214吸光度。在相同条件下加入20%健康人血清后培养24h，HUVE C活力是0.749±0.183吸光度。但加入含20% STF后培养24h，细胞活力是0.408±0.09吸光度，明显下降。

　　2.4　内皮细胞形态STF与内皮细胞一同孵育12h，HUVEC无明显形态改变，但24h部分HUVEC 变性，从培养板上脱落、坏死。未脱落的HUVEC则出现细胞收缩，胞间隙增大，胞浆出现空泡，胞核固缩等变化。而健康人血清与HUVEC孵育24h，未发现HUVEC有明显形态改变(图1，2)。

　　图1　与健康人血清一同孵育24h，人脐静脉内皮细胞形态无明显变化，呈卵圆形，互相融合(伊红考斯亮兰染色×400)

　　图2　与痂下水肿液一同孵育24h，人脐内皮细胞明显收缩，细胞间隙增大(伊红考斯亮兰染色×400)

　　Fig 1　HUVECs showed oval shape at 24h after incubation with volunteer's sera (coomassie blue staining ×400）

　　Fig 2　HUVECs showed spindle shape and retracte d at 24h after incubation with STF(coomassie blue staining ×400）3　讨论

　　烧伤后由于微血管通透性增加，痂下水肿液在人体烧伤后可迅速产生。烧伤皮肤、皮下组织释放的毒性产物如“烧伤毒素”，以及由于炎性细胞浸润等导致炎症介质、细胞因子也可聚集于STF中，并通过STF的回吸收进入全身血液循环。在临床上观察到，随着水肿液回吸收，严重烧伤病人全身炎症反应，血流动力学改变等加重，且我科既往研究表明痂下水肿液中内毒素和MDA［2］含量较高，可超过烧伤血清中含量，因此，提出痂下水肿液可能是烧伤后机体内一个重要“贮毒库”的概念。为进一步论证痂下水肿液的毒性作用，我们将ST F与HUVEC一同孵育，检测培养液中LDH、6-keto-PGF1α含量的变化及内皮细胞活力和形态改变。LDH广泛存在于人体各组织细胞内，当细胞受损时可释放出来，损伤越重释放量越多。6-keto-PGF1α为PGI2的稳定代谢产物，内皮细胞受损时，其释放量增多。实验证实STF与内皮细胞一同孵育1h培养液中LDH和6-keto-PGF1α即升高，而且随孵育时间延长而进一步升高，提示STF可损伤内皮细胞，并随作用时间延长而渐加重。实验同时发现STF可降低内皮细胞活力，改变内皮细胞形态，使内皮细胞变性、坏死。与之相对照在相同条件下，健康人血清则对内皮细胞无明显损伤作用。痂下水肿液损伤内皮细胞，导致血管通透性增高，进而可加速水肿液的形成，可能在烧伤后机体内构成一种恶性循环。而且，内皮细胞损伤是多脏器功能损伤的病理基础，随着STF的回吸收，STF可能将加重烧伤后脏器、组织的损伤。Ferrara JJ［3］曾研究表明烧伤病人痂下水肿液加到体外培养的正常人淋巴细胞中，可导致刀豆素原诱导的淋巴细胞增殖反应的完全抑制，并认为ST F是一个活性库，当吸收入全身循环系统后可抑制细胞免疫作用。因此，STF在烧伤后机体损伤发生机理中可能起重要作用，及早清除STF，必将有利于烧伤后机体的康复。由于痂下水肿液损伤内皮细胞的机理尚不十分清楚，有待今后进一步研究。

　　参考文献

　　1　安静，杨宗城，黎鳌.胎儿脐静脉内皮细胞培养.第三军医大学学报.1990，1 2：102-104.

　　2　周一平，杨磊，田传俭，等.烧伤创面早期切痂植皮与感染的实验研究.解放军医学杂志，1997，22：6-7.

　　3　Ferrara JJ,Dyess DL,Luterman A,et al.Transportation of immuno-suppressur e substances produced at the site of burn injury into the systemic circulation:T he role of Lymphatics.J Burn Care Rehabil,1990,11:281-287.