细胞凋亡与创伤愈合

　　创伤的异常愈合是临床和基础医学的一大难题，关于其形成机理，目前尚未完全阐明，临床上更无有效的预防和治疗手段。创伤的异常愈合以创面肉芽组织中有效细胞数目及细胞外基质量的改变为病理特征。近年，随着细胞生物学和分子生物学的进展，发现创伤的异常愈合与创面肉芽组织中细胞成分的凋亡异常密切相关。本文就创伤愈合过程中的细胞凋亡情况及与细胞凋亡有关的因素综述如下。

　　1　有关凋亡

　　自1972年Kerr wvllie 和Currie首次报道细胞凋亡现象以来，细胞凋亡现象及其机制一直是生命科学研究的热点。细胞凋亡的基本过程是细胞表面接到诱导因子刺激并将信号传入细胞内部，触发细胞内部的死亡程序，主要通过内源性DNA内切酶的激活导致细胞自然死亡。它是生物体以细胞有丝分裂相反的方式保持细胞群体相对稳定的生物学过程，此过程发生紊乱导致发育异常和肿瘤发生。

　　细胞凋亡过程以浓缩为特征。镜下可见细胞体积缩小，密度增加，细胞表面微绒毛消失细胞膜内陷皱褶，形成泡样结构，最后形成胞膜包裹的凋亡小体(apoptosis body)。 凋亡小体中溶酶体有完整的胞膜，不释放水解酶，因而不能引起邻近细胞的炎症反应。

　　凋亡细胞的染色质断裂是有控降解，DNA双链在核小体连接部断裂，形成180-200bp片段或数倍大小的片段，在琼脂糖凝胶电泳中呈现梯形图谱，这种特征已被作为细胞凋亡的特异性标志。

　　2　创伤愈合过程中的凋亡现象

　　2.1　创伤愈合的基本过程包括：炎症反应期、肉芽组织形成期、肉芽组织塑性、瘢痕成熟期。在创伤的早期-炎症反应期及肉芽组织塑性期，由于炎症细胞的浸润、新生血管形成及成纤维细胞的增生、创面的上皮化等原因，创面内的细胞数目较多。当肉芽成熟、塑性向瘢痕组织转化时，大量的细胞消失。正常成熟的瘢痕组织在病理上以细胞外基质为主(主要是Ⅰ、Ⅲ型胶原)，细胞成分较创伤初期明显减少。大量的研究证实这些细胞是通过凋亡途径被清除的。Desmouliere等报道在创面闭合早期，创面内的肌成纤维细胞就发生凋亡，并且该作用对靶细胞是持续的［1］。这一观察结果与瘢痕形成后逐步吸收，死亡细胞被巨噬细胞及邻近细胞吞噬等现象相吻合。这也许是临床上用皮片或皮瓣覆盖肉芽创面后，可减少创面的挛缩和增生的生物学机制。

　　2.2　创面的异常愈合包括：创面不愈、溃疡形成、瘢痕增生、瘢痕疙瘩形成等。其中慢性溃疡病理上以创面内有效细胞成分减少，细胞外基质减少为特点；瘢痕疙瘩则表现为有效细胞成分和细胞外基质的增多；增生性瘢痕介于正常愈合和瘢痕疙瘩之间，也表现为一定程度的细胞和细胞外基质的增多。

　　肉芽组织中的主要细胞成分是肌成纤维细胞，它不但保持了成纤维细胞的各种生理功能，而且具有平滑肌细胞的某些特点，如：具有微丝束、分泌α-actin从而产生一定的收缩作用，这与创面的收缩有关。有实验证实，在创伤愈合晚期大部分肌成纤维细胞通过凋亡途径死亡，而在瘢痕过度增生或纤维化疾病中则长期存在［2］。Darby等人通过细胞增殖率和凋亡检测，对照研究糖尿病大鼠和正常大鼠全厚皮缺损的创伤模型发现：创伤7天时，正常大鼠创面内细胞增殖率明显高于实验组；对照组中细胞凋亡很少，且凋亡多发生在创面愈合晚期瘢痕形成时，而糖尿病组中凋亡细胞较多且出现时间较早［3］。

　　T-淋巴细胞是早期创面内重要的炎症细胞，在炎症消退以后，包括T-淋巴细胞在内的众多炎症细胞通过凋亡途径消失。诱发T-淋巴细胞凋亡的原因可能是激活了CD 95或因为某些细胞因子如白细胞介素(IL)-2的丧失［4～5］。由细胞因子减少所引起的T-淋巴细胞的凋亡可以通过以下途径来抑制：①通过增加细胞因子如白介素-2，4，5，7等提高抑制凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL的表达，并且促进T-淋巴细胞的增殖；②成纤维细胞源性的细胞因子也可以抑制T-淋巴细胞的凋亡，但它们只提高Bcl-XL的表达，而不提高Bcl-2的表达，并且不刺激T-淋巴细胞的增殖［6］。T-淋巴细胞凋亡的异常可能引起创面慢性炎症的存在。

　　上述研究结果表明创伤异常愈合与创面内细胞的凋亡异常密切相关。

　　3　相关的凋亡调控基因

　　3.1　p53基因　p53是至今发现与人类肿瘤相关性最高的基因。p53基因位于人类17号染色体短臂(17p13.1)，全长约16～20kb，由11个外显子和10个内含子组成，其中外显子2，4，，5，7，8分别编码5个进化过程中高度保守的结构区域。野生型p53编码一个含393个氨基酸的核磷蛋白约(53kDa)，作为核内转录因子，可控制涉及细胞周期的某些蛋白质的表达［7］。

　　正常p53的功能象“分子警察”，监视细胞基因组的完整性，如果DNA受到损伤，WT- p53诱导细胞进入G1静止期，使复制停止，以便有足够的时间修复损坏的DNA。如果修复失败，p53能够通过凋亡引发细胞自杀，阻止有癌变倾向的基因突变细胞产生。体外实验证实，用射线照射细胞可使细胞内的p53蛋白增加，但其mRNA并未相应增加，这提示DNA损伤后p53蛋白的增加是通过转录后机制，延长了p53蛋白的半衰期［8］。

　　p53正常生理功能的丧失与p53基因突变、p53蛋白与病毒癌蛋白结合、与特殊扩增的细胞基因产物结合有关。p53突变与肿瘤形成密切相关，有证据表明在人类的恶性肿瘤中有50%以上存在p53的突变。突变的p53基因不仅抑癌作用丧失，反而具有促进恶性转化的活性，p53基因由抑癌基因转化为癌基因。

　　p53并不是凋亡必不可少的调控基因，它可能是作为其它基因的转化因子或转录因子参与了凋亡过程。同时，p53对其它凋亡基因的表达有调控作用，它可下调凋亡抑制基因bcl-2的表达，并可选择性地抑制原癌基因c-cmy的转录［9～10］。

　　由于瘢痕疙瘩有瘤样增生的特点，使人们怀疑其是否也存在p53基因的突变。Saed等用单链构像多态性检测(SSCP)和DNA直接测序法发现所有7例瘢痕疙瘩组织和细胞中都存在p53基因突变，其中以外显子4上72位点的替代突变为热突变(CGC CCC，arginine proline)，而同一患者的正常皮肤成纤维细胞则未发现突变，同时他们还发现，在瘢痕疙瘩中，成纤维细胞的凋亡速率明显低于正常成纤维细胞，这可能是因为在外界凋亡刺激因子作用下，突变的p53蛋白不能介导凋亡，提示p53突变是瘢痕疙瘩形成过程中的重要因素［11］。我们用SSCP法检测了3例瘢痕疙瘩组织中p53外显子5，未发现突变存在，这可能说明p53基因外显子5的突变并不是瘢痕疙瘩形成的必要条件。

　　3.2　bcl-2 家族　原癌基因bcl-2 是一多基因家族成员，该家族同源蛋白在进化过程中高度保守，包括抑制凋亡的bcl-2、bcl XL、BAD等及促进凋亡的Bax、Bcl Xs、Bak等［12～13］。bcl-2 (B cell lymphoma/leukemia-2)是该家族中最受重视的癌基因，全长230kb，其编码的蛋白分子量为24-26kDa［14］。它首先被从滤泡状非霍奇金B细胞淋巴瘤患者的14和18染色体t(14∶18)易位断裂点克隆。体外转染研究表明，剥夺了白介素3、4或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的造血干细胞因bcl-2蛋白的表达而免于凋亡，bcl-2缺陷的转基因鼠因过量的凋亡性细胞死亡引起免疫系统的发育受损。bcl-2阻碍细胞凋亡的机理可能在于, bcl-2与凋亡促进基因Bax拮抗，抑制细胞色素C自线粒体释放至胞质，阻止胞质细胞色素C对caspase蛋白酶(cysteine-containing aspartate-specific protease)的激活，从而抑制凋亡［15］。

　　bcl-2的功能形式是双聚体。Bax与bcl-2可形成异源双聚体，在一定比例条件下，Bax抑制bcl-2的作用而呈现促进凋亡作用。bcl-2家族成员均存在于线粒体、内质网膜，其作用机制与传统的信号传递因子有一定区别［16］。另一方面，Bax的表达受p53调控，p53 可通过Bax对凋亡起正调作用。

　　Wassermann等通过研究增生性瘢痕患者和正常人外周血单核细胞表面凋亡调节蛋白的表达发现，增生性瘢痕组中bcl-2蛋白的含量较对照组明显升高，增生性瘢痕及其周围正常组织成纤维细胞体外培养后用免疫过氧化物酶法检测未能检测出bcl-2［17］。这一现象提示创伤异常愈合的根本原因可能与于机体内环境的异常有关。

　　3.3　FAS及其配体(FAS Ligand)　这是调控凋亡的最重要的一组基因。FAS L是TNF家族成员，有150个氨基酸区域与TNFα同源。这些配体不仅可以在细胞表面表达，而且可以游离形式存在于体液中。FAS广泛地存在与多种细胞表面，是I型膜蛋白，其细胞外区是FAS L相应的结合区，胞质内有约70个氨基酸的特殊序列，称为“死亡结构域”。一般认为FAS/FAS L结合激活蛋白水解酶，使细胞凋亡［18］。但实际上FAS/FAS L诱导调控细胞凋亡的机制十分复杂，其生理作用受死亡调变分子(death adaptor molecules)、Caspase及FAS的负调控基因-Saf(Suppressor of apoptosis by Fas)［19］等密切相关。

　　Wassermann等人的研究还发现增生性瘢痕患者外周血单核细胞上FAS受体水平较正常愈合者无明显差别，而体外培养的成纤维细胞上FAS则明显减少。结合上述的bcl-2水平的变化，可说明在增生性瘢痕中诱导细胞凋亡的复杂的信号传导过程失平衡，导致肌成纤维细胞凋亡的减少，从而引起瘢痕的增生和挛缩［17］。

　　另外线虫凋亡基因(ced)、Interleukin converting enzyme (ICE)等在细胞凋亡调控中都发挥重要的作用，但它们与创伤愈合的关系目前尚未见报道。

　　4　其它相关因素

　　4.1　生长因子　众多的生长因子已被证实在创伤愈合过程中起重要作用，它们参与调节细胞的增殖周期、调节细胞外基质的分泌。Desmouliere等人的研究表明，肉芽组织中的肌成纤维细胞是一种终末分化的细胞，对于生长因子有一定的依赖性，随着创面闭合、炎症消退，生长因子的浓度降低，从而可能诱发细胞凋亡。另外，在上皮化后可能选择性地分泌某些细胞因子诱导细胞的凋亡［2］。Gregory B等报道，TGF-beta可诱导产生一种黏附分子-TIF2，它可以帮助细胞抵御肿瘤坏死因子(TNF)的杀伤作用，从而阻止细胞的凋亡［20］。Funato等用TUNEL法检测碱性成纤维细胞生长因子诱导大鼠正常腭部粘膜成纤维细胞和腭部瘢痕成纤维细胞凋亡的作用,发现在bFGF诱导下，瘢痕成纤维细胞凋亡明显高于正常成纤维细胞［21］。David等人发现，在糖尿病鼠溃疡创面上外用胰岛素样生长因子-2(IGF-2)和血小板源性生长因子(PDGF)可减少创面肉芽阻止中的细胞凋亡［22］。

　　4.2　细胞外基质　在向瘢痕转化的肉芽组织中存在细胞的凋亡现象，而在体外培养的瘢痕组织原代细胞中，即使在无血清培养的条件下也不出现凋亡［23］，导致这种差异的原因目前尚不清楚。细胞外基质对胚胎发育、创伤愈合、肿瘤浸润、转移及纤维化等有着重要的作用，而体外培养成纤维细胞时，细胞外基质与体内环境有着显著的区别，这可能是体外培养的成纤维细胞不发生凋亡的重要原因。Boudreau等报道，阻断与细胞外基质的相互作用，表皮细胞发生凋亡［24］。Fluck等在胶原制成的三维支架上行瘢痕成纤维细胞原代培养，发现较单层细胞培养，前者DNA合成减少、细胞静止退化、DNA电泳出现大量的低分子量片段，证明有凋亡的存在［25］。这可能是因为三维培养可使细胞达到一定的密度，同时三维培养可使氧、营养物质、细胞因子自由交换。

　　另外，细胞间的连接蛋白、旁分泌因子等也可能是调节成纤维细胞凋亡的重要因素。

　　创伤的异常愈合在病理上以瘢痕组织中的细胞成分的多少、细胞的功能状况以及细胞外基质组成等的改变为特征，这些都与细胞凋亡异常密切相关。从细胞增殖和凋亡失平衡入手，将有助于进一步阐明创伤异常愈合的机制。生长因子及其受体在创伤愈合过程中有着重要的作用，关于生长因子及其受体与细胞凋亡的关系，目前报道较少，有望成为创伤愈合领域中新的研究方向。

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