山茱萸总甙对正常小鼠T淋巴细胞免疫功能影响的实验研究

　　摘要：研究了从山茱萸中提取的山茱萸总甙对正常小鼠T淋巴细胞及其亚群和产生IL-2的 影响，以期探讨山茱萸总甙的免疫抑制机理。结果表明：山茱萸总甙不同剂量均可抑制 T淋巴细胞增殖（P＜0.01）、T淋巴细胞膜表面CD3的表达（P＜0.01）和抑制T淋巴 细胞膜表面 CD4、CD8的表达（P＜0.05或P＜0.01），中大剂量还可以提高CD4/CD8的比值，说明山 茱萸总 甙抑制CD8的作用比抑制CD4的作用更明显。不同剂量的山茱萸总甙还可以抑制T淋巴细胞产 生IL-2(P＜0.05或P＜0.01）。抑制IL-2的产生可能是山茱萸总甙抑制机体免疫功能 的主要机理之一。

　　中图分类号：R285.5

The Effects of the Total Glycoside from Cornus Officinalis

　　on Immunologic Function of T Lymphocytes in Healthy Mice

Li Jianmin (李建民), Zhou Yong (周　勇), Xiang Jingchen (项静辰), et al.

　　(Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beijing 100029)

　　The effects of the total glycoside extracted from Cornus officin alis ( TGECO) on T lymphocytes and T lymphocyte subgroup, and the IL-2 production of T lymphocytes were studied in healthy mice in order to explore the immunosuppressi ve mechanism of TGECO. The results showed that all the different TGECO doses cou ld inhibit the multiplication of T lymphocytes (P＜0.01), CD3 surface expres sion in T lymphocytes (P＜0.01), and CD4 and CD8 surface expression in T lymphocy t es (P＜0.05 or P＜0.01); besides, middle and large TGECO doses could inc rease the rati o of CD4/CD8, which implies that the TGECO effect of inhibiting CD8 is stronger than that of inhibiting CD4. The results also showed that all the different TGEC O doses could inhibit the IL-2 production of T lymphocytes (P＜0.05 or P ＜ 0.01), which may be one of the main causes of the immunosuppressive effects of TGECO.

　　KEY WORDS: Total Glycoside from Cornus Officinalis; T Lymphocyte; Mouse; I mmunologic Function

　　近年来对于山茱萸的实验研究发现：山茱萸的水煎剂具有免疫抑制作用，其提取物山 茱萸总甙等也有明显的免疫抑制作用。我们以往的研究工作表明:山茱萸总甙具有免疫抑制 作用,在本实验中我们初步探讨了山茱萸总甙(total glycosides from cornus officinalis ,TGCC）对正常小鼠T淋巴细胞增殖及其亚群和产生IL-2的影响,现报道如下。

　　1　材料与方法

　　1．1　动物

　　BAlB/C小鼠一级，雌性，体重为18～20 g，购于中国预防医学科学院流行病与微生 物研究所，合格证号为医动字第01-3058号。C57BL/6J小鼠一级, 雌性,体重18～22 g,购于 中国预防医学科学院流行病与微生物研究所,合格证号为医动字第01-3059号。

　　1．2　药物与试剂

　　（1） 山茱萸总甙胶囊由中日友好医院临床研究所药物药理室赵世萍研究员提供。批号为： 991129，用蒸馏水溶解，用碳酸氢钠调pH 7.2，按人60 kg体重折算的10倍为临床等效剂量 作为小鼠实验的中剂量用量，用于实验研究。

　　（2） 地塞米松,片剂,规格0.75 mg/片,由天津市力生制药厂生产,批号为: 9807003。用生理盐水配制,按人60 kg体重折算的10倍为临床等效剂量作为小鼠实验的中剂 量用量。

　　（3） 试剂：RPMI 1640培养基，美国GIBCO公司产品，加入25 mmol/L的Hepes，16 mmol/L NaH CO3,0.1 mol/L丙酮酸钠，0.01 mol/L 2-巯基乙醇，过滤除菌，使用时加入青霉素100 U/mL，链霉素100 mg/mL，2 mmol/L谷氨酰胺，配成10%灭活的胎牛血清培养基即为完全RPMI 1640培养基 。ConA、LPS 均为美国Sigma产品。3H-TdR为中国原子能科学研究院产品。荧光标记抗体，CD3为FITC标 记抗体、 CD4为PE标记抗体和CD8为FITC标记抗体，购于北京医科大学免疫研究中心。染色缓冲液： 0 .1%NaN3,2%NBS，pH 7.4 0.15 mol/L PBS 100 mL，购于北京医科大学免疫研究中心。

　　1．3　主要仪器

　　高速冷冻离心机，德国HERMLE,Z360K。CO2日本池本理化工业株氏会社RJK。倒置显微镜 ，重庆光学仪器厂。超净工作台，北京市半导体设备厂。低温冰箱，日本SANYO。电子天平A E100,瑞士。多头微量细胞收集器，绍兴坡塘医疗械器厂。液体闪烁计数仪，美国Beckman。 流式细胞计,美国 COULTER公司EPICS XL. 液体闪烁计数仪，美国Beckman。

　　1．4　方法

　　1．4.1制备脾细胞悬液： 将上述BAlB/C小鼠60只,随机分为正常组、地塞米松组及山茱萸总甙大、中、小组，每组 12只,连续灌胃7d，处死小鼠，分离脾细胞，制备单个脾细胞悬液。

　　1．4.2　T淋巴细胞增殖实验［1］: 将上述脾细胞悬液调细胞浓度为5×109L-1。加入96孔培养板中，100 μL/孔， 同时每孔加 入100 μL含ConA（终浓度5 mg/L）的1640完全培养基，每组12孔,置37 ℃、5%CO2培养 箱中 孵育72 h， 培养结束前6 h加入3H-TdR 1.85×104 Bq/孔，最后用多头微量细胞收集 器收集细胞于49型玻璃纤维纸上，以液闪仪测定细胞的掺入值（cpm）。

　　1．4.3　山茱萸总甙对正常小鼠T细胞亚群影响：采用流式细胞术检测［2］。取上述每组8只动物的脾细胞悬液，调细胞浓度为1×109L-1。取出1 mL细胞悬液, 分加入EP管中,用荧光洗液洗2次，每次加入荧光洗液0.5 mL, 每次均为4 ℃离心1 200 r/mi n，7 min,分别加入荧光标记的抗体,其中抗CD3mAb为50 μL,抗CD4和CD8 mAb 各为20 μL, 混匀,4 ℃，30 min,用荧光洗液洗2次，每次加入荧光洗液0.5 mL, 每次均为4 ℃离心1 200 r/min，7 min 。用PBS液0.5 mL重悬细胞，经200目尼龙膜过滤后以流式细胞计检测T细胞亚群，整个染色 过程均在4 ℃冰浴中进行。

　　1．4.4　IL-2测定：采用胸腺细胞增殖法［2］。(1)IL-2的诱生：将上述脾细胞悬液，调细胞浓度为5×109L-1，加入到24孔培 养板中，1 mL/孔 ，同时每孔加入10 μL含ConA（终浓度5 mg/L）的1640完全培养基，置37 ℃、5%CO2培 养箱 中孵育48 h，2 000 r/min离心10 min，吸取上清，即为IL-2的粗制品，-20 ℃保存待测。

　　(2)IL-2的测定：采用胸腺细胞增殖法，采用雌性C57BL/6J小鼠，无菌分离其胸腺，按常规 制备胸腺悬液，调细胞浓度为5×109L-1，加入96孔培养板中，100 μL/孔，并使C onA的终浓度为3 mg/L，然后加入不同稀释度的IL-2样品(1∶2和1∶4)，每种稀释度重复6 孔,置37 ℃、5%CO2 培养箱中孵育72 h， 培养结束前6 h加入3H-TdR 1.85×104Bq/孔，最后用多头微量细 胞收集器收集细胞于49型玻璃纤维纸上，以液闪仪测定细胞的掺入值（cpm）。

　　1．4．5　统计方法：实验结果进行统计学t检验，以±s表示。

　　2　结果

　　2．1　山茱萸总甙对正常小鼠T淋巴细胞增殖的影响

　　结果见表1。

　　2．2　山茱萸总甙对正常小鼠T细胞亚群的影响

　　结果见表2。

　　2．3　山茱萸总甙对正常小鼠脾细胞产生IL-2的影响

　　结果见表3。

表1　山茱萸总甙对正常小鼠T淋巴细胞增殖的影响 (±s)

组　别 n 剂量 cpm
生理盐水组 12 - 131769.4±11793.2
 
地塞米松组 12 0.125 mg/kg 31642.5±10957.7**
山茱萸总甙组 12 0.08 g/kg 108315.8±10032.8**
山茱萸总甙组 12 0.16 g/kg 78675.8±15494.6**
山茱萸总甙组 12 0.32 g/kg 63105.1±22001.8**

　　注：与生理盐水组比较**P＜0.01

表2　山茱萸总甙对正常小鼠T细胞亚群的影响(±s )

分　组 n 剂量 CD3／% CD4／% CD8／% CD4/CD8
生理盐水组 8 -
 47.56±3.59
 35.51±1.39
 18 .88±1.03
 1.89±0.11
 
地塞米松组 8 0.125 mg/kg
 37.48±0.50** 26.95±1.67* * 14.10±1.06** 1.92±0.11
山茱萸总甙组 8 0.08 g/kg 46.35±0.99 25.69±10.10* 17.28±1.90  1.47±0.54
山茱萸总甙组 8 0.16 g/kg 46.48±1.64 31.41±1.08** 15.00±1 .16** 2.10±0.16**
山茱萸总甙组 8 0.32 g/kg 43.36±1.15** 28.13±2.47** 13.45±1.56** 2.10±0.13**

　　注：与生理盐水组比较*P＜0.05　**P＜0.01

表3　山茱萸总甙对正常小鼠脾细胞产生IL-2的影响 (±s)

组　别 剂量 cpm(1∶2) cpm(1∶4)
生理盐水组 -
 15487.9±4988.1
 10638.8±4999.0
 
地塞米松组 0.125 mg/kg
 3468.8±1033.1** 3670.3±1502.6* *
山茱萸总甙组 0.08 g/kg 7022.3±2200.5** 8637.4±6442.6*
山茱萸总甙组 0.16 g/kg 3010.2±1025.2** 3252.2±2513.9**
山茱萸总甙组 0.32 g/kg 2912.0±1490.3** 2981.3±2485.8**

　　注：与生理盐水组比较*P＜0.05　**P＜0.01

3　讨论

　　山茱萸为山茱萸科植物山茱萸的果肉，具有补肝肾、涩精气、固虚脱的作 用。近年来对于山茱萸的实验研究发现：山茱萸的提取物山茱萸总甙具有较强的免疫抑制作 用［4～8］,是山茱萸免疫抑 制的主要有效部位。机体的免疫应答反应是一个极其复杂的过程，T淋巴细胞的活化、增殖 需 经抗原、有丝分裂原的刺激后表达IL-1受体，在IL-1作用下，T淋巴细胞活化，并由G0期 进 入G1期，活化后的T淋巴细胞合成IL-2，并表达IL-2受体，IL-2与高亲和力的膜受体结 合 相互作用，刺激T淋巴细胞进入S期，进行增殖和分化。因此，IL-2是T淋巴细胞增殖的关键 免疫促进因子。本实验研究结果表明：山茱萸总甙的大、中、小三种不同剂量均可以抑制T 淋巴 细胞增殖（P＜0.01）、T淋巴细胞膜表面CD3的表达（P＜0.01）和抑制T淋巴细胞 膜表面CD4、 CD8的表达（P＜0.05或P＜0.01），中大剂量还可以提高CD4/CD8的比值，说明山茱萸总 甙抑制 CD8的作用比抑制CD4的作用更明显。不同剂量的山茱萸总甙还可以抑制T淋巴细胞产生IL-2 （P＜0.05或P＜0.01）。抑制IL-2的产生可能是山茱萸总甙抑制机体免疫功能的主要 机理之一。

　　国家新药研究基金 (No.96-901-05-177)

　　李建民， 男， 37岁， 在读医学博士， 副主任医师

参　考　文　献

　　1，汪　谦. 现代医学实验方法. 北京：人民卫生出版社， 1997. 690～692

　　2，陈　奇. 中药药理研究方法学. 北京：人民卫生出版社， 1994.774～775

　　3，赵武述，张玉琴，赵世萍，等. 山茱萸成分的免疫活性研究. 中日友好医院学报，1990 ，21（3）：17～20

　　4，赵武述，张玉琴，赵世萍，等.山茱萸的免疫药理研究(Ⅱ)总甙部分抑制免疫反应的体 外效应. 中日友好医院学报， 1991，5（2）：71～75

　　5，赵武述，张玉琴，赵世萍，等. 山茱萸的免疫药理研究(Ⅲ)　总甙部分与环孢菌素A体外 作用的比较及协同作用. 中日友好医院学报， 1991，5（3）：139～144

　　6，赵武述，李　洁，张玉琴，等. 山茱萸总甙抑制免疫的体内效应及其对移植心脏存 活的延长. 中华微生物学和免疫学杂志， 1995，15（5）：325～327

　　7，李　洁，赵武述，张玉琴，等. 山茱萸免疫药理活性. 中日友好医院学报， 1996，10 （1）：43～45

　　8，赵世萍，陈玉武，郭景珍，等. 山茱萸总甙的抗炎免疫抑制作用研究. 中日友好医院学 报， 1996，10（4）：295～298