止消通脉宁对糖尿病大鼠肾小球细胞外基质成分的影响

www.cnkang.com 2007-3-24 17:31:00 中华康网

　　摘要：采用链脲佐菌素（STZ）腹腔注射建立糖尿病大鼠模型，观察中药复方止消通脉宁对其肾小球细胞外基质（ECM）成分的影响。结果显示：止消通脉宁能够明显减少糖尿病大鼠肾小球ECM主要成分ColIV 、FN 、LN的积聚，具有抑制ECM增生的作用，从而可以延缓糖尿病肾病发生发展的病理进程。

　　中图分类号：R285.5

Effects of Zhixiotongmaining Granules on the Components of

　　Glomerular Extracellular Matrix in Diabetic Rats

Wang Yaoxian (王耀献), Zhou Jianhua (周建华), Zhao Jinxi (赵进喜), et al.

　　（Dongzhimen Hospital, Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beiji ng 100700）

　　The effects of Zhixiaotongmaining Granules (ZG) on the component s of g lomerular extracellular matrix (ECM) were observed in the rats with diabetes ind uced by streptozotocin. The results showed that ZG could significantly decrease the accumulation of the type IV collagen, fibronectin and laminin, and inhibit E CM proliferation. The results imply that ZG can delay the onset and development of diabetic nephropathy.

　　KEY WORDS: Zhixiaotongmaining Granules; Experimental Diabetes; Components of Glomerular Extracellular Matrix; Immunohistochemistry; Semi-quantitative Anal ysis; Rat

　　糖尿病肾病（DN）是多种因素共同作用而致肾小球细胞外基质（ECM）增生的结果。其典型病理特征是肾小球基底膜（GBM）增厚, ECM主要是纤维连　接蛋白（FN）、层粘连蛋白(LN)和IV型胶原(ColⅣ)积聚增加所致的系膜基质增多、系膜区扩张，最后导致了弥漫性肾小球硬化，故又称糖尿病性肾小球硬化症。因此，本实验拟观察中药复方止消通脉宁对实验性糖尿病大鼠肾小球ECM成分的影响，以探讨其阻止糖尿病肾小球ECM增生的作用。

　　1　材料与方法

　　1．1　动物

　　健康雄性纯种SD大鼠，体重(180±5)g，由北京市实验动物中心提供。

　　1．2　试剂、药品

　　链脲佐菌素（STZ）、胃蛋白酶、DAB显色试剂盒为Sigma产品，SP试剂盒为Lymed公司产品，ColⅣ、FN、LN兔抗鼠抗体分别购自上海医科大学、中山生物工程公司。

　　止消通脉宁醇提剂（每mL含生药2 g）,由北京中医药大学中药学院制剂室制备；糖适平（30 mg/片），北京第六制药厂生产；洛丁新（10 mg/片），北京诺华制药有限公司生产。

　　1．3　模型制备

　　用0.1 mmol/L枸橼酸缓冲液（pH 4.0, 4 ℃）STZ配成2%的溶液，以50 mg/kg剂量腹腔注射；正常对照组仅给等量缓冲液。72 h后，测定空腹血糖为13～25 mmol/L者列入观察。

　　1．4　实验分组

　　大鼠注射STZ 3 d后分为模型组、中药治疗组、西药治疗组。中药治疗组予止消通脉宁30 g/(kg.d)灌胃，西药治疗组予糖适平15 mg/(kg.d)、洛丁新1.5 mg/(kg.d)灌胃，模型组不做任何处理，予普通饲料、自由饮水。

　　1．5　免疫组化染色观察

　　于实验16周末处死大鼠，取肾，制石蜡切片备用。具体步骤如下：切片脱蜡至水；3%过氧化氢水，30 min灭活过氧化物酶，PBS冲洗；胃蛋白酶溶液，37 ℃孵育60～120 min；滴加1%BSA，室温20 min；倾去BSA，加入一抗，4 ℃过夜；PBS冲洗；滴加二抗，37 ℃，30～60 min；PBS冲洗，加入SP复合物，37 ℃，10～30 min；PBS冲洗；DAB显色，5～10 min；苏木素复染，常规脱水、透明、封片。用光学显微镜对免疫组化结果进行半定量分析，按下面标准分级：（+）阳性染色区域不超过系膜区的25%；（++）阳性染色区域占系膜区的25%～50%；（+++）阳性染色区域占系膜区的50%以上。

　　1．6　统计学分析

　　对等级资料进行Ridit分析。

　　2　结果

　　2．1　大鼠肾小球ColⅣ免疫组化

　　结果见表1。

　　2．2　大鼠肾小球FN免疫组化

　　结果见表2。

　　2．3　大鼠肾小球LN免疫组化

　　结果见表3。

表1　各组大鼠肾小球ColⅣ免疫组化的比较

组　别肾小球数/n + ++ +++
n % n % n %
模　型　组 47 12 25.5 22 46.8 13
27.7　

中药治疗组 43 25 58.1 16 37.2 2 4.7西药治疗组 51 20 39.2 27 52.9 4 7.9

　　注：与模型组相比P＜0.01

表3　各组大鼠肾小球LN免疫组化的比较

组　别肾小球数/n + ++ +++
n % n % n %
模　型　组 50 17 34.0 21 42.0 12
24.0 　

中药治疗组 37 23 62.2 13 35.1 1 2.7
西药治疗组 44 24 54.6 17 38.6 3 6.8

　　注：与模型组相比P＜0.013　讨论

　　3．1　DN时肾小球ECM的异常改变

　　肾小球ECM包括GBM、肾小球系膜基质和肾小囊基膜，是多种成分形成的高度有序的网络状结构。ECM不但维系着肾小球的正常结构，而且在肾小球的发育、体内平衡和疾病的发生、发展方面均起着一定作用。许多肾小球疾病的进展与肾小球ECM的积聚密切相关。ECM不但包括肾小球原有的基质成分的增多，还有非正常肾小球基质成分的表达。DN时以肾小球ECM 增生为特点，典型的病理改变是GBM增厚和以肾小球系膜区为主的ECM积聚［1］。我们以往研究发现，糖尿病大鼠至16周时可见肾小球系膜区增宽扩张、GBM增厚，经定量分析处理，肾小球系膜区平均面积、GBM厚度等均与正常对照组存在显著性差异［2］。与其他组织的ECM一样，肾小球ECM也主要由胶原（collagen）、糖蛋白（glycoprotein）和蛋白聚糖（proteoglycan）组成［3］。其中ColⅣ是构成肾小球基膜网状结构的支架，占肾小球基膜干重的50%。FN、LN是构成ECM的两种主要的非胶原糖蛋白，FN 主要分布于系膜基质中，LN则主要存在于GBM中。故此三者的改变可充分反映肾小球ECM的变化。DN时正是由于肾小球ColⅣ、FN、LN等正常ECM成分的过度积聚，才导致GBM增厚和系膜扩张，成为出现蛋白尿、肾功能进行性下降等临床症状的基础。本实验结果证实，在糖尿病大鼠肾脏中，ECM主要成分ColⅣ、FN和LN显著增加。

　　3．2　ECM积聚与肾络病变

　　我们认为，DN是一种继发于糖尿病的微血管病变，病变部位主要在肾络，属于中医典型的肾络病变。肾络病变不仅包括肾小球血液动力学改变，也包括了ECM病变。“初为气结在经，久则血伤入络。”糖尿病日久，肾络气阴两虚，气虚无力运血，阴虚血涩难行，加之阴虚燥热，灼津成痰，或络中津液停聚为湿，痰湿阻滞气机，气郁热郁，结果痰、郁、热、瘀充斥络脉之中，肾之络脉瘀结肿胀，形成微型NF8FE瘕积聚。这一认识与现代医学是一致的，现代医学认为是长期高血糖以及由之引起的代谢紊乱、多种细胞因子分泌异常等，共同作用于肾脏，引起肾小球ECM增生。本实验肾脏免疫组化结果显示，糖尿病时肾小球ECM主要成分明显积聚，提示“肾络微型NF8FE瘕”是客观存在的。

　　3．3　止消通脉宁阻止ECM积聚的作用

　　ECM积聚是DN肾脏病理的基本特点，是引起DN蛋白尿与进行性肾功能衰竭的基础。因此能否抑制ECM积聚，是判断某种药物对DN有无防治作用的金指标。

　　止消通脉宁是针对DN “气阴两虚、肾络瘀结”基本病机而设，具有益气养阴、散积化瘀之功，既治消渴血瘀，又防久病入络；脉络得通，气血调和，故能收效。以往实验［2 ］及本实验结果证实，经止消通脉宁治疗的糖尿病大鼠肾小球病理改变程度以及ColⅣ 、FN 、LN免疫组化结果均较模型组明显为轻，提示止消通脉宁能够抑制系膜增生、GBM增厚，减少ColⅣ、FN、LN等ECM成分积聚，具有抑制ECM增生的作用，从而延缓DN发生发展的病理进程。

　　王耀献，男，34岁，医学博士，主治医师

参　考　文　献

　　1，张雪涛.细胞外基质增殖在糖尿病肾病的作用.中华肾脏病杂志，1997，13（5）：315～317

　　2，王耀献，原爱红，赵　雁，等.止消通脉宁对糖尿病大鼠肾小球形态改变的影响及定量分析.北京中医药大学学报，1999，22（4）：19～20

　　3，王金泉.肾小球细胞外基质结构、功能的改变与糖尿病肾病.肾脏病与透析肾移植杂志，1 995，4（3）：259～263