止消通脉宁对糖尿病大鼠肾组织醛糖还原酶和山梨醇脱氢酶活性的影响

www.cnkang.com 2007-3-24 17:32:00 中华康网

　　摘要：利用链脲佐菌素（STZ）糖尿病SD大鼠模型，观察了中药复方止消通脉宁及典型的醛糖还原酶抑制剂(Sorbinil)对大鼠肾组织醛糖还原酶（AR）和山梨醇脱氢酶（SDH）活性及肾脏病变的影响。结果表明糖尿病大鼠经上述两种药物治疗后，肾脏AR活性明显下降，SDH活性显著升高，血糖、 24 h尿白蛋白含量显著下降，肾重及肾重/体重显著降低，且止消通脉宁组疗效优于Sorbinil组。提示中药复方止消通脉宁可改善多元醇代谢，为临床上使用止消通脉宁防治糖尿病肾病提供了一定的实验依据。

　　中图分类号：R285.5

Effects of Zhixiaotongmaining Granules on the Activity of Renal Aldose

　　Reductase and Sorbitol Dehydrogenase in Diabetic Rats

Yang Jun (杨　君), Lu Renhe (吕仁和), Qin Ying (秦　英), et al.

　　（Dongzhimen Hospital, Beijing University of Traditional Chinese Medicine, Beiji ng 100700）

　　The effects of Zhixiaotongmaining Granules (ZG) and Sorbinil (a typica l aldose reductase inhibitor) on the activity of renal aldose reductase (AR) and sorbitol dehydrogenase (SDH), and on renal lesions were observed in SD rats wit h streptozotocin-induced diabetes. The results showed that after the rats were t reated with ZG and sorbinil respectively, the renal AR activity was significantl y lowered, SDH activity was significantly raised, the levels of blood sugar and urinary albumin in 24 hours were markedly decreased, and the renal weight and th e ratio of renal weight/body weight were markedly lowered; and in the treatment, ZG manifested better effects than sorbinil. The results imply that the traditio nal Chinese drug, ZG, can improve polyol metabolism, and can be used in the prev ention and treatment of diabetes.

　　KEY WORDS: Diabetic Nephropathy; Aldose Reductase; Sorbitol Dehydrogenase; Zhixiaotongmaining Granules; Aldose Reductase Inhibitor

　　中药复方止消通脉宁是在临床实践中总结出的治疗糖尿病肾病的有效方剂［1］，本文研究了止消通脉宁及典型的醛糖还原酶抑制剂Sor bini l对糖尿病大鼠肾组织AR活性、SDH活性的影响，探讨了中药复方止消通脉宁防治糖尿病肾脏病变的意义。

　　1　材料与方法

　　1.1　实验动物

　　46只雄性SD大鼠随机分出10只为正常对照组，另36只采用一次性腹腔内注射STZ（65 mg /kg）制造糖尿病模型（标准：注射STZ 48 h后，空腹血糖≥16.67 mmol/L）。将造模成功的大鼠随机分为糖尿病模型组、止消通脉宁治疗组［5 g/（kg·d）］和sorbinil治疗组［ 10 mg/（kg·d）］，并于次日开始给药，观察期为8周。疗前各组间无显著性差异，具有可比性。

　　1.2　实验方法

　　于治疗用药后第4周和第8周各测定体重、血糖和24 h尿白蛋白1次，第8周末时将大鼠断头处死，速取双侧肾脏，去除肾盂、肾包膜，称重，液氮速冻后，密封存于-70 ℃冰箱中保存待用。

　　(1)肾组织AR活性测定：参照Marayondakis、Chakrabarti等的方法［2，3］，略作变动，记录NADPH在340 nm处吸收光值下降来表示酶活性。本研究使用两种反应体系，第一种反应体系包括：67 mmol/L、pH 6.2的Na+-K+磷酸缓冲液，10 mmol/L的DL-甘油醛，5 m mol/L 2-巯基乙醇，0.1 mmol/L的NADPH和酶适量；实验杯包括全部试剂，对照杯以双蒸水代替底物DL-甘油醛。第二种反应体系以0.1 mmol/L的NADH代替NADPH,其余试剂同第一种反应体系。测定组织匀浆酶活性，同时测定蛋白含量（改良lowry法）。1单位酶活性规定为1 min产生1 μmol N ADP+（或NAD+）的酶量，各组织酶活性用比活性进行比较，比活性=酶单位/mg。

　　(2)肾组织SDH活性测定［4］：①反应合剂的组成：1 mL合剂由1 mol/L Tris-Hcl （pH 8.0）100 μL、50 mmol/L NAD+ 100 μL、200 mmol/L MgCl2 100 μL、200 mm ol /L山梨醇500 μL及水组成。②测定方法：反应合剂200 μL与组织匀浆液20 μL于试管内，在37 ℃孵育60 min。取孵育液20 μL于0.01 mmol/L的磷酸钾缓冲液(pH 7.4)4 mL中以终止反应,做荧光比色。③制作标准曲线：根据以下公式计算SDH活性：E=FC/A［E：SDH活性；F：净荧光读数；C：校正因素C=（10×A1）/F1，其中F1为NADH标准曲线上1 μmol/L NADH的荧光读数，A1为组织匀浆标准曲线上0.1 g/L组织匀浆的吸光度；A：孵育混合液吸光度］。

　　(3)血糖：大鼠尾静脉取血后，采用Accutrend alpha型血糖仪测定。

　　(4)尿白蛋白：采用放射免疫分析法测定。

　　1.3　主要试剂与仪器

　　岛津RF-520荧光分光光度计（日本岛津产品），722型分光光度计（日本岛津产品），NADPH 、NADH（分析纯，sigma公司产品），DL-甘油醛（分析纯，意大利Roth公司产品），Sorbin il（美国Pfizer公司产品），止消通脉宁颗粒剂（北京中医药大学东直门医院自制药），NA D+、山梨醇及STZ为sigma产品。

　　1.4　统计学分析

　　计量资料值以均数±标准差（±s）表示，各配伍组样本均数比较，采用方差分析。

　　2　结果

　　2.1　止消通脉宁对糖尿病大鼠空腹血糖、24 h尿白蛋白含量的影响

　　结果见表1。

表1　各组动物空腹血糖（FBS）及24 h尿白蛋白含量（±s）

组　别　 FBS/mmol/L 24 h尿白蛋白/mg/L
4周 8周 4周 8周
正常对照组 5.69±0.52
5.62±0.78
1.25±0.13
1.25±0.14
模型组 18.23±0.72△△ 21.67±3.43△△ 3.60±0.54△△ 4.05±0.65△△
止消通脉宁组 9.84±2.53..▲ 10.36±1.27..▲ 1.93±0.5 .. 1.79±0.39·▲
Sorbinil组 14.25±1.97 15.33±1.20 2.09±0.44 2.36±0.51

　　注：与正常对照组比△△P＜0.01；与模型组比·P＜0.05　..P＜0.01；与Sorbinil组比▲P＜0.05

　　从表1看出，4周和8周时模型组空腹血糖和24 h尿白蛋白含量同正常对照组相比均显著升高（P＜0.01）；止消通脉宁组和Sorbinil组与模型组相比，血糖、24 h尿白蛋白显著下降（P＜0.01或P＜0.05），止消通脉宁作用优于Sorbinil（P＜0.05）。

　　2.2　止消通脉宁对糖尿病大鼠体重、肾重、肾重/体重的影响

　　结果见表2。

表2　各组动物体重、肾重及肾重/体重比较（±s）

组　别体重/g 肾重/g 肾重/体重/×103
4周 8周
正常对照组 232.57±20.01
327.71±13.93
1.43±0.13
4.51±0.64

模型组 185.25±24.52△△ 201.60±17.58△△ 1.88±0.22△ △ 9.72±1.47△△
止消通脉宁组 221.36±21.86 234.89±17.99 1.58±0. 08 7.09±0.75
Sorbinil组 214.72±23.51 215.85±16.14 1.61±0.10  7.75±0.76

　　注：与正常对照组比△△P＜0.01；与模型组比·P＜0.05　..P＜0.01 　　从表2可见，4周和8周时模型组体重同正常对照组相比明显下降（P＜0.01 ），实验8周末，模型组肾重、肾重/体重较正常组显著升高（P＜0.01）。用止消通脉宁和Sorbinil 治疗后体重显著增加（P＜0.01或P＜0.05），肾重、肾重/体重显著下降（P＜0.01），两治疗组间无显著差异（P＞0.05）。

　　2.3　止消通脉宁对糖尿病大鼠肾组织AR活性的影响

　　分别以还原型辅酶Ⅱ（NADPH）和还原型辅酶Ⅰ（NADH）测定肾组织AR活性，结果见表3。

　　从表3可以看出，模型组AR活性显著高于正常组（P＜0.01），而使用止消通脉宁及Sorbi nil治疗后AR活性明显下降（P＜0.01），虽两治疗组AR活性仍高于正常对照组，但与正常对照组相比较无显著性差异（P＞0.05）。以NADH为辅酶检测AR活性，AR活性较以NADP H为辅酶测定酶活性为低，用这二种辅酶分别测得酶活性有良好相关性（r=0.9366）

表3　各组动物肾组织AR活性（±s）

组　别 AR活性/mU/mg
NADPH NADH
正常对照组 1.03±0.78
0.37±0.24

模型组 7.33±1.26△△ 5.81±1.35△△
止消通脉宁组 3.50±0.79 0.80±0.38
Sorbinil组 3.37±0.83 0.97±0.26

　　注：与正常对照组比△△P＜0.01；与模型组比..P＜0.01

2.4　止消通脉宁对糖尿病大鼠肾组织SDH活性的影响

　　结果见表4。

表4　各组动物肾组织SDH活性（±s）

组　别 SDH活性/μmol/mg
正常对照组 6.45±1.79

模型组 2.82±1.37△△
止消通脉宁组 5.89±1.64
Sorbinil组 3.65±1.72

　　注：与正常对照组比△△P＜0.01；与模型组比..P＜0.01

　　表4结果表明，实验8周末，模型组肾脏SDH活性显著降低（P＜0.01），应用止消通脉宁治疗后SDH活性显著升高（P＜0.01），与正常对照组相比无显著性差异（P＞0.05），而用Sorbinil 治疗后效果不明显（P＞0.05）。

　　3　讨论

　　本文从多元醇代谢角度探讨了中药复方止消通脉宁治疗糖尿病肾病的作用机制。AR为糖代谢多元醇通路的关键限速酶。糖尿病高糖条件下，催化葡萄糖转化为山梨醇，对组织细胞形成渗透性损伤，由于AR与其生理底物葡萄糖亲和力较低，故一般研究用与AR亲合力较高的甘油醛为底物，采用由NADPH、NADH两种辅酶组成的反应体系来测定AR活性。结果发现STZ糖尿病大鼠肾组织AR活性较正常鼠明显升高，运用醛糖还原酶抑制剂sorbini l后其活性显著降低，而应用止消通脉宁治疗后AR活性也明显下降，表明中药复方止消通脉宁具有显著的醛糖还原酶抑制剂的作用。

　　在多元醇代谢途径中，AR催化葡萄糖转变为山梨醇，同时SDH又将山梨醇转化为果糖，进入糖代谢的其他通路，从而降低细胞渗透压，对细胞起保护作用。这也可能是糖尿病并发症呈现缓慢过程的原因之一。但目前对于糖尿病高糖状态下SDH活性变化的文献报道较少，对其认识也不统一。有报道在分离的肾小球及培养的系膜细胞中有SDH活性存在［5］，国内丁氏等报道随血糖升高，红细胞SDH活性降低，且二者呈负相关关系［6］。但也有报道说糖尿病肾组织中SDH活性变化不明显［7］。我们的实验结果表明，实验8周末，糖尿病大鼠肾组织S DH活性较正常组显著降低，应用sorbinil治疗后，SDH活性变化不明显，而应用止消通脉宁治疗后SDH活性显著升高，说明糖尿病时山梨醇的蓄积不仅有AR活性的增强，与SDH活性降低也密切相关，止消通脉宁在降低AR活性的同时还可使SDH活性增高，这一作用是醛糖还原酶抑制剂所不具备的。

　　除AR活性升高、SDH活性降低外，糖尿病大鼠还伴有非常显著的肾脏肥大，肾重和肾重/体重比值明显增加，我们认为这种病理改变除与糖尿病肾病早期肾小球高滤过、高灌注有关外，可能还与多元醇通路异常，AR活性增高致山梨醇在细胞内大量积聚，破坏肾组织细胞的结构与功能有关。另外，经大量临床总结发现糖尿病肾病早期病机为气阴两虚，痰热郁瘀阻滞脉络［1］，这种阻滞是络脉内形成微小瘕积聚的开始，与多元醇代谢异常时，山梨醇在肾小球基底膜和毛细血管内膜上的积聚很相似。止消通脉宁由黄芪、细生地、鬼箭羽、夏枯草、莪术、大黄、三七等药物组成，具有益气养阴，化瘀散结作用。方中黄芪、细生地益气养阴；鬼箭羽破血通脉；夏枯草清肝泻火，化瘀散结；莪术行气破血、消积止痛；三七散血止血，散而不破，止而不滞，并有修复脉络的作用；大黄清热逐瘀通经，能 “破瘕积聚，推陈致新”。本实验研究表明，止消通脉宁能降低糖尿病大鼠肾组织AR活性，增高SDH活性，阻断多元醇代谢通路，使肾脏肥大病理变化有所改善，其肾重和肾重/体重比值较模型组明显降低，并可降低血糖，减少尿白蛋白，延缓糖尿病肾脏病变发生、发展，这可能是止消通脉宁防治糖尿病肾病的作用机制之一，此作用优于醛糖还原酶抑制剂Sorbinil。

　　“九五”国家科技攻关项目资助课题(No.96-906-09-08)

　　杨君，女，29岁，医学博士；现工作单位：海军总医院　北京100037

参　考　文　献

　　1，吕仁和,高彦彬,王　越,等.止消通脉宁治疗糖尿病肾病的临床与实验研究.第二届糖尿病(消渴病)国际学术会议论文集, 1996:51

　　2，Marayondakis ME, Wasvary J, Hankin H, et al. Human placenta aldose reductase forms sensitive and insensitive to inhibition by alrestatin. Mol Pharmacol, 198 4,(25):425

　　3，Chakrabarti S, Sima AAF, Nakajima, et al. aldose reductase in the BB rat: i solation, immunological identification and locolization in the retina and perip heral nerve. Diabetologia, 1987,30:244

　　4，Vaca G, Zuniga P, Medina C, et al. A fluorimetric method for red blood cell s orbitol dehydrogenase activity. J Clin Pathol, 1983,36:697

　　5，吉川隆一. 糖尿病性腎症にぢける腎系球体机能异常.糖尿病, 1985,28:1378

　　6，丁　立,姚正元,王晓玲. 糖尿病患者红细胞山梨醇脱氢酶活性的研究.中国糖尿病杂志, 1996,(2):119～120

　　7，Sochor M, Kujar S, Mclean P. The effect of aldose reductase inhibitor statil (ICI 128436)on the glucose over-utilization in kidney of diabetic rats. Biochem ical Pharmacology, 1988, 37:3349