放线共生放线杆菌的白细胞毒素

　　放线共生放线杆菌(简称A.a)是早发性牙周炎(EOP)尤其是局限性青少年牙周炎(LJP)的重要致病菌。在A.a的各种毒力因子中［1］，白细胞毒素(Ltx)得到了广泛关注。不同的A.a株产生Ltx的能力不同。高毒力株JP2生成的Ltx是低毒力株652的10-20倍［1］，这种显著的差异对A.a的致病力有着决定性意义［2］。牙周病变部位的A.a分离株所产生的Ltx远高于健康部位的分离株［2］。43-75%的牙周病变部位的A.a分离株可产生Ltx，即Ltx+，而80%以上的健康人分离株则不具备这种能力，即Ltx-［3］。JP2样高毒力A.a株仅在LJP中可分离到，在健康个体或成人型牙周炎(AP)中只发现652样低毒力株［4］。为进一步了解A.a的致病机理，本文综述了A.a的Ltx的分子特征及作用机理。

　　1　概　述

　　Ltx属于RTX毒素家族的一员。RTX是G-致病菌产生的大分子量(100，000-110，000)，Ca2+依赖性细胞穿孔毒素［5］，包括大肠杆菌(Escherichiacoli)的α溶血素，胸膜肺炎放线杆菌(A.pleuropneumoniae)的溶血素，菊属欧文菌(Erwiniachrysamthemi)的金属蛋白酶等［3］。RTX成员的基因组成相仿，4个基因按转录顺序C，A，B，D排列构成操纵子。A是结构基因，C编码激活毒素的蛋白，B、D的基因产物与毒素的转运定位有关［6］。

　　2　Ltx的蛋白组成和功能

　　2.1　Itx基因产物

　　Itx的操纵也由C，A，B，D4个基因组成基因产物分别发挥特定作用。根据氨基酸序列将ltxA的基因产物分为4个区域：N端、中心区、重复区、C端。

　　N端(残基1-408)：由疏水和亲水基团交替组成。二级结构中包含22个α螺旋，其中有2个疏水基团和5个与跨膜和成孔相关的两歧性螺旋。该区的变异导致ltx毒性丧失，提示N端与毒素和靶细胞膜的相互作用有关。

　　中心区(残基409-729)：包含大量的亲水基团。

　　重复区(残基730-900)：由9个氨基酸GGXGXDXUX(X是任一氨基酸，U可为L，I，U，W，Y或F之一)前后重复而成。

　　C端(残基901-1055)：该区的缺失造成毒素在胞浆内潴留，所以C端和分泌蛋白相关［7］。C端的末124个氨基酸与RTX其余成员截然不同，并且C端还有4个半胱氨酸，这也是RTX中独一无二的。C端对RTX的分泌必不可少，因而C端在结构上的独特之处使A.a的Ltx的分泌转运有别于RTX的其他毒素［7］。

　　上述4区中与Ltx的种特异性相关部分是残基688-941。如将该残基的基因嵌合入溶血性巴斯菌(Pasteurellhaemolytica)的相应部分，溶血性巴斯菌的白细胞毒素发生种特异性变异，使只杀伤牛靶细菌细胞的溶血性巴斯菌的白细胞毒素可杀伤人靶细胞。该区由14个前后重复的GGXGXDXUX构成。已明确绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)这种重复区的三维结构为平行的β片层状构型，其中GGXGXDXUX形成连续的右手螺旋β转折。重复区具有如下特点：1原核生物中，这种GGXGXD序列属RTX和某些酶(如金属蛋白酶)特有：2包含重复区的蛋白质通过分泌蛋白如B、D的基因产物而不是大多数细胞蛋白采取的经典信号系统转移至膜，说明重复区与一种新的分泌过程有关［7］。除形成β转折外，GGXGXD还构成一系列Ca2+结合点。用同位素标记的Ca2+检测发现Ltx对Ca2+的亲和力为10-7M。细菌胞浆内Ca2+水平低，Ltx的Ca2+结合点未被占据，因而处于弹性状态，便于向膜的移位。一旦分泌至胞外，Ca2+浓度上升，结合位点饱和，Ltx则形成有细胞毒作用的三维结构C［7，8］。相邻两个重复区末端的X之间构成β链，连接前后两个β转折。

　　ltxA的基因产物pI值在8.2至9.7之间［9，10］，这种高pH值可能与靶细胞特异性和毒素的转运分泌有关。A.a感染位点pH值常在8.0以上，所以这种异乎寻常的pI可能还与A.a入侵牙周袋有一定联系［10］。

　　2.2　ltxC基因产物

　　ltxC与RTX其余成员的相应基因至少有52%的同源性。RTX的激活需要C基因产物发挥作用。大肠杆菌的溶血素须经翻译后的修饰才具有生物活性，其中脂肪酸酰化激活过程需要溶血素C基因产物和另一种酰基载体蛋白参与。ltxC的产物可能与溶血素C作用相似［7］。

　　2.3　ltxB、D基因产物

　　在B、D基因产物参与下，ltx通过非肽依赖的信号系统转运至细胞表面，与核酸以离子的形式结合［7，9］。ltxB-、D-的变异株ltx水平可下降5倍以上，这种变异株内ltxA和mRNA均无改变，之所以下降可能是ltx异位的间接结果［2］。

　　3　Ltx水平的决定因素

　　A.a的不同分离株合成Ltx的能力差别颇大。如将JP2生成Ltx的水平定为100%，则Y4产生的Lx仅有10%，33384只有2%。影响Ltx水平的因素较多，可大致分为基因和环境两大类：

　　3.1　基因因素

　　3.1.1　启动子

　　JP2和652均有C，A，B，D4个基因，但启动子不同。JP2含有P1、P2两个启动子，在ltxC的上游还有一个小的开放阅读框架(ORF)。P1启动后，ORF、C、A共同转录一个4.2Kb的mRNA。ORF在体外可翻译一条10KDa的蛋白，体内作用不明。P2启动后，C、A转录一个3.8Kb的mRNA。JP2的启动子还能使C，A，B，D转录一个8Kb的mRNA，但起点不明。上述3种mRNA中3.8KbmRNA是优势mRNA。652只有一个启动子P，启动C，A转录成3.8Kb的mRNA，也可启动C，A，B，D转录成极少量的8KbmRNA。与JP2的ORF相比，652的ORF多530bp，因而652ORF不与ltx的操纵子共同转录，或者这额外的530bp使ltx启动子与C，A，B，D分离，致ltx形成无效转录。JP2由于具有两个启动子且ORF较小，所以转录效率远高于652。ltx形成两套启动子的机制还不为人所知，推测JP2可能由652丢失这530bp之后转化而来。Brogan等对JP2和652之外的15个A.a分离株的启动子分析后发现：启动子与652相似的13株Ltx水平与652相似，与JP2相仿的2株Ltx水平与JP2类似，两种水平的Ltx差别也达10-20倍。这一现象显示启动子与Ltx水平密切相关［11］。

　　3.2　转录

　　不同Ltx水平的A.a株mRNA水平有差异。Spitzn-agel按mRNA水平对A.a株排序，结果如下：JP2＞Y4＞ATCC29253＞ATCC33384，与它们生成Ltx的能力一致［3］。这种直接的联系提示Ltx可在转录水平得到调节。推测C基因产物可能参与ltx转录的调节［3］。但mRNA不能完全解释Ltx水平的变化，所以Ltx或许还受到转录后相关蛋白的调节。

　　3.2　环境因素

　　3.2.1　生长周期

　　Ltx的mRNA水平在生长周期中发生显著变化。对数生长期mRNA水平上升，进入静止期则明显下降。提示环境刺激将通过生长周期的影响而改变Ltx水平。

　　3.2.2　培养条件

　　Kolodrubetz用β一半乳糖苷酶与JP2形成嵌合子AAM17，发现Ltx的产量在厌氧条件下是有氧环境中的3-4倍，而与Fe离子浓度无关［2］。Ohta将Ltx-ATCC33384在化学恒定器培养基内培养，发现有活性的Ltx生成。301-6在厌氧，pH=7.0的果糖培养基内生长，无明显Ltx生成。在牙周袋这种独特的微环境内，pH值、氧压、营养获得性、细胞间的相互作用都构成影响A.a毒力因子表达的环境因素［9］。

　　4　Ltx对靶细胞的作用

　　A.a的Ltx是RTX家族中靶细胞特异性极高的毒素，仅作用于人PMN，巨噬细胞以及一些高等灵长类的靶细胞。Rabie报道A.a的Ltx对淋巴细胞有非致死效应［13］，Simpson认为这种效应与时间、温度相关［14］。Mangan发现A.a的Ltx对人淋巴细胞具有时间、浓度依赖的杀伤作用，Ltx＞=10ng/ml时即有细胞死亡，100ng/ml，24hr,50%的T细胞死亡［12］。

　　A.aLtx之所以能产生插膜成孔的破坏作用在于它可稳定地以两种状态存在：水溶相和插膜相。两相间的转换需要发生结构改变，有可能通过一个部分展开的球状可溶媒介物。两相转换必须跨越高能障碍，其意义在于自发状况下不发生转换，更重要的是特异性的靶细胞与Ltx结合之后展开球状媒介物的部分折叠，降低能量障碍，从而保证了靶细胞特异性。转换受到多种因素的影响。可溶性球体的弹性能增加插膜区疏水核心的可达性，使之易与膜接触。插膜区的层状结构允许螺旋层在膜表面扩展，仅发生局部构造的改变而不破坏螺旋本身［7］。

　　Mangan研究表明A.aLtx可通过类似细胞坏死和程序性细胞死亡(PCD)两种方式杀伤T细胞。发生坏死或PCD与膜损害的速度和过程有关。快而重的损害则出现坏死，轻而慢则发生PCD。10-100ng/mlLtx可在T细胞内造成最大量的DNA片段(PCD的标志)，Ltx＞100ng/ml，DNA片段的量不变或下降，说明低浓度的Ltx引发PCD，高浓度则以坏死为主。Ltx造成DNA片段的机制不明，Ltx可能直接作为核酶，或激活内源性核酶［12］。Ltx介导的溶解涉及阳离子选择的孔道的快速形成，最终使靶细胞渗透性溶解［11］。RTX的另一成员A.pleuropneumoniae的溶血素在红细胞形成的孔径约2nm，孔道导体水平约350-400ps，具有典型的跨膜通道特性［15］。RTX各毒素作用机制相似，A.aLtx形成的孔道可能具有类似特点。

　　A.aLtx可使人PMN、巨噬细胞、T细胞发生PCD或坏死，即A.a能在牙周病变区损害细胞免疫和体液免疫，这与A.a的致病性关系密切［12］。

　　目前对Ltx结构和功能的了解有助于认识牙周病的病理过程并在牙周病治疗中采取相应措施，如利用不同A.a株Ltx水平不同，选择Ltx-株作适当处理后植入Ltx+病变位点使无毒株与有毒株形成生态拮抗，达到抗菌治疗难以得到的效果。但对Ltx仍有许多未明了之处，如Ltx发生两相转换的关键因子是什么，Ltx以何种方式识别靶细胞，除C、A、B、D之外，是否还有别的基因影响Ltx的生成、分泌、定位，ORF作用何在等等，均有待进一步的探索。

　　作者单位：华西医大口腔医学院口腔内科

　　参考文献

　　［1］Taylor PF et al. J Priodontol. 1996; 67(3 Supplement): 291-297

　　［2］Kolodrubetz D.J Priodontol. 1996; 67(3 Supplement): 309-317

　　［3］Spilznagel J JR et al. Infect Immun. 1991; 59(4): 1394-1401

　　［4］Zambon JJ et al. J Priodontol. 1996; 67(3 Supplement): 282-290

　　［5］Strathdee CA et al. J Bacteriol. 1989; 171(3): 916-921

　　［6］Mcwhinney DR et al. J Bacteriol. 1992; 174(1): 291-297

　　［7］Lally ET et al. J Priodontol. 1996; 67(3 Supplement): 298-308

　　［8］Lally ET et al J Bio Chem. 1994; 269(49): 31289-31295

　　［9］Ohta H et al. Infect Immun. 1993; 61(11):4878-4883

　　［10］Kraig E et al. Infect Immun. 1990; 58(4): 920-929

　　［11］Brogan JM et al. Infect Immun. 1994; 62(2): 501-508

　　［12］Mangan DF et al. Infect Immun. 1991; 59(9): 3267-3273

　　［13］Rabie G et al. Infect Immun. 1988; 56(1): 122-127

　　［14］Simpson DI et al. Infect Immun. 1988; 56(5): 1162

　　［15］Lalonde G et al. J Bio Chem. 1989; 264(23): 13559-13564