大鼠睾丸支持细胞雄激素结合蛋白mRNA在生精周期中的表达

www.cnkang.com 2007-1-13 9:22:00 中华康网

　　摘　要　目的　研究大鼠睾丸支持细胞(sertoli cell,SC)雄激素结合蛋白(ABP)mRNA水平与曲细精管上皮周期的相关关系。方法　以地高辛标记的大鼠ABP cDNA探针在SD大鼠睾丸冰冻切片上进行原位杂交，应用激光密度扫描系统对阳性信号进行定量。结果　ABP mRNA在Ⅰ-Ⅵ期维持低水平；Ⅶ-Ⅷ期迅速升高，达到高峰；Ⅸ-Ⅺ期骤然下降，但仍高于Ⅰ-Ⅵ期水平，Ⅹ　Ⅱ-Ⅹ　Ⅳ期又略有回升；随后迅速下降至Ⅰ-Ⅵ期水平。结论　 SC内ABP mRNA水平具有明显的生精周期依赖性变化。

　　关键词：支持细胞　雄激素结合蛋白　睾丸

　　精子发生是一个极其复杂的过程，在这一过程中，曲细精管上皮在形态及生化方面均要经历周期性的变化［1］。作为曲细精管上皮中的一种体细胞，支持细胞在生精过程中发挥着重要作用。支持细胞最重要的功能之一是分泌多种蛋白质，近20多年的研究表明，支持细胞分泌的蛋白已达数十种之多，其中雄激素结合蛋白(androgen binding protein,ABP)是最早被分离鉴定的一种蛋白，能特异性地结合雄激素，调节血液、生殖管道内雄激素浓度。目前它已被广泛用作研究睾丸，包括支持细胞(sertoli cell,SC)生理、病理及激素调控的一个指标［2］，但其生物学功能尚不完全清楚。为探讨ABP在精子发生过程中的作用，本实验应用原位杂交方法对大鼠生精过程中睾丸支持细胞的ABP mRNA水平进行动态观察。

　　材料和方法

　　材料　动物：健康雄性SD大鼠4只，体重400 g左右，由药检所实验动物中心提供。探针：大鼠ABP cDNA,探针长度为1.4 kb,内有一EcoRⅠ的酶切位点，载体为psp65。质粒DNA由North Carolina大学David Joseph教授提供。试剂盒：地高辛DNA标记和检测试剂盒(DIG DNA Labeling and Detection kit)为Boehringer Mannheim公司产品。

　　cDNA片段的制备　参照文献［3，4］的方法，将含ABP cDNA的重组质粒用氯化钙法转化大肠杆菌DH5α菌株，筛选转化成功者小量制备质粒，用EcoR Ⅰ酶切鉴定。大量扩增含正确cDNA质粒的细菌克隆，碱裂解法提取质粒，用PEG法(PEG8000)纯化，限制性内切酶消化，低熔点琼脂糖凝胶电泳法回收cDNA片段，测定OD260和OD280值，计算DNA浓度，其余置-20℃保存备用。用地高辛DNA标记和检测试剂盒标记和检测cDNA探针。探针浓度约30 ng/μl。

　　组织冰冻切片的制备　大鼠断头处死后迅速取出睾丸，经液氮速冻后，于-20℃恒冷箱切片机中切片，片厚8～10 μm，用新鲜配制的4％多聚甲醛固定，PBS冲洗，待切片晾干后-20℃保存备用。相邻的两张切片中一片用于原位杂交，另一片进行PAS染色，在光镜下确定每个曲细精管属哪一期，以此为依据，确认原位杂交切片中各曲细精管的分期，本实验分曲细精管为Ⅰ、Ⅱ-Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ-Ⅷ、Ⅸ-Ⅺ、Ⅹ　Ⅱ-Ⅹ　Ⅳ期7个阶段。

　　原位杂交　参照文献［5］的方法，室温下用含5 mmol/L MgCl2的PBS和2×SSC洗切片，预杂交液37℃预杂交1 h,杂交液(含新变性的探针约2 ng/μl)于37℃杂交16 h［以杂交液中除去探针作阴性对照，以标记的细胞内视黄酸结合蛋白-Ⅰ(cellular retinoic acid binding protein -Ⅰ，CRABP-Ⅰ)作阳性对照，公认它位于睾丸生精细胞内］。用2×SSC、1×SSC、0.5×SSC于室温下依次清洗切片，于封闭液中封闭30 min,于抗体溶液中孵育2 h，加入新鲜配制的显色液，暗处显色满意后，TE终止显色。梯度酒精脱水，二甲苯透明，树脂封片，镜检并摄影。

　　原位杂交结果的定量及统计学处理　采用Pharmacia LKB Ultroscan XL激光密度扫描系统对原位杂交结果进行灰度扫描，以其平均相对灰度值作为ABP mRNA量的参数，数据以均数±标准误(X±sX)表示，对灰度扫描数据进行方差分析和SNK检验。

　　结　　果

　　制备的质粒DNA的限制性内切酶酶切分析　用质粒转化大肠杆菌，小量制备质粒DNA后用EcoR Ⅰ消化，经琼脂糖凝胶电泳后可见有650和750 bp目的cDNA片段(图1)。

　　图 1　含ABP cDNA重组质粒酶切电泳分析图

　　fig 1　Restriction endonuclease analysis of recombinant plasmid containing rat ABP cDNA

　　a:rat ABP plasmid/EcoR I;B:marker pBR322/BstNⅠ　　原位杂交的结果分析　光镜下可见SC中有蓝色颗粒状阳性杂交信号，生精细胞中无阳性信号。阳性信号Ⅶ-Ⅷ期最强，Ⅰ-Ⅵ期较弱，且Ⅶ-Ⅷ期以近管腔处较密集，主要分布在长形精子细胞周围，基底部比较稀疏(图2)；阴性对照未见阳性杂交信号(图3)，阳性对照可见阳性杂交信号位于生精细胞(图4)。生精过程中大鼠睾丸ABP mRNA水平的变化情况如图5所示：Ⅰ-Ⅵ期轻度增加，但仍维持在低水平；至Ⅶ-Ⅷ 期迅速升高，达到高峰，增长幅度达170％；Ⅸ-Ⅺ期骤然下降，但仍高于Ⅰ-Ⅵ期水平；至Ⅹ　Ⅱ-Ⅹ　Ⅳ期又略有回升；随后迅速下降至Ⅰ-Ⅳ期水平。方差分析显示各个阶段之间差异有显著性意义(P＜0.01)，进一步做SNK检验显示其中Ⅶ-Ⅷ期分别与Ⅰ、Ⅱ-Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅸ-Ⅺ期之间差异有显著性意义(P＜0.05)。

图 5　大鼠睾丸曲细精管上皮周期中ABP mRNA相对平均灰度值的变化

　　fig 5 　Variation of the relative average gray level of the specific hybridizable ABP mRNA in the SC of the seminiferous tubule of rat testis during the epithelial cycle*P＜0.05 compared with stage Ⅶ-Ⅷ；AU：arbitrary densitometric units

　　讨　　论

　　大鼠ABP(rABP)是一相对分子质量为85 000的糖蛋白二聚体，含相对分子质量为45 000和41 000两个以非共价键相连的多肽亚单位，分别被命名为rABP(H)和rABP(L)，两者比例为3∶1，两者有相似的多肽链及相似的甾酮结合位点，不同之处在于糖基化程度。rABP基因全长约5.5 kb,rABP mRNA长1.7 kb［6］。在体和离体研究均表明SC是睾丸中唯一合成ABP的细胞，本实验也观察到生精细胞中不表达ABP。ABP mRNA位于SC，其水平有明显的周期性改变，Ⅰ-Ⅵ期维持在低水平，Ⅶ-Ⅷ期迅速升高，达高峰，Ⅸ-Ⅺ期骤降，但仍高于Ⅰ-Ⅵ期水平，至ⅩⅠⅠ-ⅩⅠⅤ期又略有回升，随后迅速下降至Ⅰ-Ⅵ期水平。这与等［7］采用微细解剖法和Northern blot 检测的结果稍有不同，他们发现ABP mRNA Ⅳ-Ⅵ期最低，Ⅵ-Ⅶ期升高，Ⅶ期较Ⅷ期略低，Ⅷ-Ⅺ期最高，随后降低。这可能是实验方法不同而造成的差异。通常认为，分泌细胞的转录水平与其分泌水平一致，Parvinen等［8］观察到ABP分泌水平Ⅰ-Ⅵ期最低，Ⅶ期升高，Ⅷ期达到最大，Ⅸ-ⅩⅠⅤ期下降，本实验的结果与ABP分泌水平的变化更为符合。

　　大量的ABP沿管腔运至附睾，而后逐渐从管腔液中消失。免疫组化方法证实大量的ABP被附睾头部近端上皮降解，而精子在附睾转运过程中逐渐获得功能上的成熟，故有人认为生精细胞不是ABP功能的靶细胞，ABP的功能可能是提高整个男性生殖管道的雄激素浓度［9］。但是，人们又观察到环绕长形精子的SC突起中存在着有免疫活性的ABP，本实验也观察到ABP mRNA的分布Ⅶ-Ⅷ期以管腔周围较密集，基底部较稀疏，而管腔周围聚集的是后期精子细胞，提示ABP在精子发生的后期更为重要。1984年Steinberger等［10］发现精母细胞膜上有rABP的特异结合位点，也存在于生活状态的生精细胞及生精细胞膜富集片段上［11］；另外，Pellinimi等［12］利用抗ABP抗体发现在精母细胞膜和精母细胞质内存在ABP。这些结果均提示SC分泌的ABP是生精过程中某几步所必需的，通过自身或作为性激素跨膜载体作用于生精细胞。总之，SC周期性分泌的ABP可能是它调节周期性精子发生的重要因素，其确切的作用机制有待进一步的研究。■

图2 ABRMRNA在大鼠睾丸曲细精管各期的分布

　　fig2 Distridution of ABP mRNA Signaling in the seminiferous tubule of testis in the rat as detected dy in siu\tu hybridization with ABP cDNA probe×200

图3 睾丸组织原位杂交的阴性对照结果

　　fig3 Negative control of in situ hybridization on testicular tissue×200

图4 大鼠睾丸曲细精管生精细胞CRABP-I mRNA阳性对照结果

　　fig 4 Postitive control,distribution of CRABP-I mRNA signaling in the germ cells of the seminiferous tubule of testis in the rat,as detected by in situ hybridization with CRABP-I cDNA Probe×200

　　bL:basal lamina;TL:tubular lumen

　　国家自然科学基金（39770778）资助

　　陈咏梅(中国医学科学院　中国协和医科大学　基础医学研究所组织胚胎教研室，北京 100005)

　　叶世隽(中国医学科学院　中国协和医科大学　基础医学研究所组织胚胎教研室，北京 100005)

　　黄玉苓(中国医学科学院　中国协和医科大学　基础医学研究所组织胚胎教研室，北京 100005)

　　郑文利(中国医学科学院　中国协和医科大学　基础医学研究所组织胚胎教研室，北京 100005)

　　参考文献

　　［1］Russel LD,Ettlin RA,Sinhahikim AP, et al.Histological and histopathological evaluation of the testis. Clearwater:Cache River Press,1990.62-118

　　［2］Griswold MD.Protein secretions of Sertoli cells.Int Rev Cytol,1988,110:133-156

　　［3］李尹雄.核酸的分离和纯化.见：卢圣栋主编.现代分子生物学实验技术.北京：高等教育出版社，1993.95-154

　　［4］郑文利，叶世隽，何星华，等.雷公藤多甙对支持细胞分泌蛋白和间质细胞LH/CG受体转录水平的影响.中国医学科学院学报，1996，18：104-110

　　［5］苏慧慈.原位杂交.北京：科学技术出版社，1994.115-157

　　［6］Joseph DR,Lawrence W.Mutagenesis of essential functional residues of rat androgen-binding protein/sex hormone binding protein globulin.Mol Endocrinol,1993,7:488-496

　　［7］Lönnerberg P,Söder O,Parvinen M, et al.β-Nerve growth factor influences the expression of androgen-binding protein messenger ribonucleic acid in the rat testis.Biol Reprod,1992,47:381-388

　　［8］Parvinen M,Vihko KK,Toppari J.Cell interactions during the seminiferous epithelial cycle.Int Rev Cytol,1986,104:115-151

　　［9］Skinner MK.Cell-cell interactions in the testis.Endocrinol Rev,1991,12:45-77

　　［10］Steinberger A,Dighe RR,Diaz J.Testicular peptides and their endocrine and paracrine functions.Arch Biol Med Exp,1984,17:267-271

　　［11］Felden F,Guéant　JL,En Nya A, et al.Photoaffinity labelled rat androgen binding protein and human sex hormone steroid binding protein bind specifically to rat germ cell.J Mol Endocrinol,1981,108:925-931

　　［12］Pelliniemi LJ,Dym M,Gunsalus GL, et al.Immunocytochemical localization of androgen binding protein in the male reproductive tract.Endocrinology,1981,108:925-931