大鼠睾丸支持细胞雄激素结合蛋白mRNA在生精周期中的表达

　　摘　要　目的　研究大鼠睾丸支持细胞(sertoli cell,SC)雄激素结合蛋白(ABP)mRNA水平与曲细精管上皮周期的相关关系。方法　以地高辛标记的大鼠ABP cDNA探针在SD大鼠睾丸冰冻切片上进行原位杂交，应用激光密度扫描系统对阳性信号进行定量。结果　ABP mRNA在Ⅰ-Ⅵ期维持低水平；Ⅶ-Ⅷ期迅速升高，达到高峰；Ⅸ-Ⅺ期骤然下降，但仍高于Ⅰ-Ⅵ期水平，Ⅹ　Ⅱ-Ⅹ　Ⅳ期又略有回升；随后迅速下降至Ⅰ-Ⅵ期水平。结论　 SC内ABP mRNA水平具有明显的生精周期依赖性变化。

　　关键词：支持细胞　雄激素结合蛋白　睾丸

　　精子发生是一个极其复杂的过程，在这一过程中，曲细精管上皮在形态及生化方面均要经历周期性的变化［1］。作为曲细精管上皮中的一种体细胞，支持细胞在生精过程中发挥着重要作用。支持细胞最重要的功能之一是分泌多种蛋白质，近20多年的研究表明，支持细胞分泌的蛋白已达数十种之多，其中雄激素结合蛋白(androgen binding protein,ABP)是最早被分离鉴定的一种蛋白，能特异性地结合雄激素，调节血液、生殖管道内雄激素浓度。目前它已被广泛用作研究睾丸，包括支持细胞(sertoli cell,SC)生理、病理及激素调控的一个指标［2］，但其生物学功能尚不完全清楚。为探讨ABP在精子发生过程中的作用，本实验应用原位杂交方法对大鼠生精过程中睾丸支持细胞的ABP mRNA水平进行动态观察。

　　材料和方法

　　材料　动物：健康雄性SD大鼠4只，体重400 g左右，由药检所实验动物中心提供。探针：大鼠ABP cDNA,探针长度为1.4 kb,内有一EcoRⅠ的酶切位点，载体为psp65。质粒DNA由North Carolina大学David Joseph教授提供。试剂盒：地高辛DNA标记和检测试剂盒(DIG DNA Labeling and Detection kit)为Boehringer Mannheim公司产品。

　　cDNA片段的制备　参照文献［3，4］的方法，将含ABP cDNA的重组质粒用氯化钙法转化大肠杆菌DH5α菌株，筛选转化成功者小量制备质粒，用EcoR Ⅰ酶切鉴定。大量扩增含正确cDNA质粒的细菌克隆，碱裂解法提取质粒，用PEG法(PEG8000)纯化，限制性内切酶消化，低熔点琼脂糖凝胶电泳法回收cDNA片段，测定OD260和OD280值，计算DNA浓度，其余置-20℃保存备用。用地高辛DNA标记和检测试剂盒标记和检测cDNA探针。探针浓度约30 ng/μl。

　　组织冰冻切片的制备　大鼠断头处死后迅速取出睾丸，经液氮速冻后，于-20℃恒冷箱切片机中切片，片厚8～10 μm，用新鲜配制的4％多聚甲醛固定，PBS冲洗，待切片晾干后-20℃保存备用。相邻的两张切片中一片用于原位杂交，另一片进行PAS染色，在光镜下确定每个曲细精管属哪一期，以此为依据，确认原位杂交切片中各曲细精管的分期，本实验分曲细精管为Ⅰ、Ⅱ-Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ-Ⅷ、Ⅸ-Ⅺ、Ⅹ　Ⅱ-Ⅹ　Ⅳ期7个阶段。

　　原位杂交　参照文献［5］的方法，室温下用含5 mmol/L MgCl2的PBS和2×SSC洗切片，预杂交液37℃预杂交1 h,杂交液(含新变性的探针约2 ng/μl)于37℃杂交16 h［以杂交液中除去探针作阴性对照，以标记的细胞内视黄酸结合蛋白-Ⅰ(cellular retinoic acid binding protein -Ⅰ，CRABP-Ⅰ)作阳性对照，公认它位于睾丸生精细胞内］。用2×SSC、1×SSC、0.5×SSC于室温下依次清洗切片，于封闭液中封闭30 min,于抗体溶液中孵育2 h，加入新鲜配制的显色液，暗处显色满意后，TE终止显色。梯度酒精脱水，二甲苯透明，树脂封片，镜检并摄影。

　　原位杂交结果的定量及统计学处理　采用Pharmacia LKB Ultroscan XL激光密度扫描系统对原位杂交结果进行灰度扫描，以其平均相对灰度值作为ABP mRNA量的参数，数据以均数±标准误(X±sX)表示，对灰度扫描数据进行方差分析和SNK检验。

　　结　　果

　　制备的质粒DNA的限制性内切酶酶切分析　用质粒转化大肠杆菌，小量制备质粒DNA后用EcoR Ⅰ消化，经琼脂糖凝胶电泳后可见有650和750 bp目的cDNA片段(图1)。