完全性葡萄胎是葡萄胎的一种类型,根据其二倍体的亲代来源可分孤雄完全性葡萄胎和双亲完全性葡萄胎]。AnCHM与BiCHM在临床表现和组织病理上是不能区分的，前者往往呈散发性,其后正常怀孕的几率很高,后者往往呈家族性、反复性，该患者一生中几乎无一次正常怀孕，要么流产、要么死胎或葡萄胎[2]；前者可通过ICSI配合PGD可以预防AnCHM,后者只能通过赠卵进行预防；另外对BiCHM的研究对揭示葡萄胎发病机理找到了切入点[3]。如何快速、简便的区分二者以成为临床医生和学者们的迫切愿望，本文用微卫星序列多态性检测法鉴别完全性葡萄胎亲代来源，以探讨其可靠性。浙江大学附属第一医院妇科钱建华

　　材料与方法

　　1.1研究对象

　　选择浙江大学医学院附属妇产科医院2004.01~2006.11和绍兴第二医院2005.11~2006.11间住院的第一次清宫且病理诊断为完全性葡萄胎病例50例。该50例患葡萄胎的妇女均未生育过,最小年龄19岁，最大年龄38岁，中位年龄25.5岁,一次葡萄胎45例,二次或二次以上葡萄胎5例,其中最多的接连5次葡萄胎。.

　　1.2试剂与仪器

　　GenePrint STR Systems 检测试剂盒购自Promega公司 (USA),共三个。分别是CTT试剂盒，同时检测CSF1PO、TH01、TPOX基因座；FFV试剂盒，同时检测FESFPS、F13A01、VWA基因座；Silver STRⅢ试剂盒，同时检测D16S539、D7S820、D13S317基因座。PCR扩增仪(Bio-rad)，双槽垂直电泳仪(北京六一厂)，凝胶扫描仪(Bio-rad quantity one software)。

　　2.1基因组DNA的提取

　　2.2 复合PCR

　　2.3琼脂糖凝胶定性电泳

　　2.4 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

　　2.5银染分析

　　结果

　　根据经典的遗传学定律对电泳图样进行读取,方法如下:1.九个位点中葡萄胎标本都只出现一电泳条带且均来自父方条带之一,则判为孤雄单精完全性葡萄胎。２．如在九个位点中葡萄胎标本出现一至两条带均来自父方条带则判为孤雄双精完全性葡萄胎。３．葡萄胎标本出现一至两条带分别均来自夫妇双方条带之一，与母方相同的条带至少在一个位点父方不能提供，则判为双亲完全性葡萄胎。４．葡萄胎标本在若干位点上出现三条带，其中两条带来自父方则判为部分性葡萄胎。本研究的50例完全葡萄胎中孤雄完全性葡萄胎为43例，占86%(其中孤雄单精完全性葡萄胎35例, 孤雄双精完全性葡萄胎8例),双亲完全性葡萄胎7例,

　　占14%,5例复发性葡萄中有2例是双亲(一例为接连五次葡萄胎患者,一例为两次葡萄胎患者)

　　,未发现部分性葡萄胎
,结果见图:

　　上三图是部分标本DNA九个位点扩增后电泳结果

　　图a :病例1(CSF1PO,TPOX,TH01)三个位点的扩增后电泳结果,葡萄胎标本出现一至两条带分别均来自夫妇双方条带之一，与母方相同的条带在二个位点父方不能提供，判为双亲完全性葡萄胎。图b:病例2(D16S539,D7S820,D13S317) 三个位点的扩增后电泳结果, 葡萄胎标本在三个位点上只出现一电泳条带且均来自父方条带之一,判为孤雄单精完全性葡萄胎。图c:病例3(F13A01,FESFPS,vWA) 三个位点的扩增后电泳结果, 葡萄胎标本出现一至两条带均来自父方条带则判为孤雄双精完全性葡萄胎。

　　讨论

　　一、鉴别单双亲完全性葡萄胎的意义

　　葡萄胎(Hydatidiform mole HM)根据组织病理可分为CHM和PHM（partial hydatidiform mole PHM）。根据基因起源,大多数PHM为双雄性来源，多一套父系染色体。大部分PHM起源于2个精子与一个卵子受精，偶有PHM可能来源于单个卵子与二倍体精子受精[ 4 5]。CHM一般为二倍体，根据基因起源可以分为两组染色体均来自父亲的父系来源的AnCHM及两组染色体分别来自父亲和母亲的双亲来源的BiCHM[1]，父系来源的完全性葡萄胎中75~80%是由一个精子(23，X)与一个空卵受精后核内DNA自身复制形成，核型为46，XX，易患葡萄胎妊娠的遗传方式提示属于常染色体隐性遗传，同一患者与不同的性伴侣婚后再患葡萄胎的事实，提示这些妇女可能具有遗传缺陷影响卵子的功能。BiCHM少见，除家族发病外，一些重复HM的散发妇女最近也证实是BiCHM，这些妇女可能代表着相同发病情况的个体。BiCHM携带有父亲和母亲染色体基因组,BiCHM与AnCHM基因起源不同却具有相同的的组织学病理特征,表达形式一致,难以区分，并且BCHM患者妊娠结局不良,这些妇女在其一生中可能没有一次正常怀孕，要么流产、死胎，要么葡萄胎。该病的发病机理至今尚未完全明了[2]。 治疗的选择:如果是双倍体双亲结构的HM建议选择卵子捐献和试管内受精（IVF），而孤雄的双倍体或三倍体结构的HM则选择ICSI+/-PGD+/-FISH[3]。BiCHM的确切发病机理和对其后生育的影响一直是困扰学者和医师们的难题，从CHM中区分出单、双亲，有利于对该病的发病机理及其诊断、治疗等问题进行系统地研究，从而为研究葡萄胎的发病机理找到切入点；有利于克服对某些习惯性流产的盲目治疗，给患者提供必要的医疗咨询。另有20~25%父系来源的完全性葡萄胎的核型为46，XY，它是由一个空卵与两个精子同时受精而成[6]。BiCHM代表HM的一种独特类型,约占完全性葡萄胎的20%,常与家族性复发性葡萄胎相关[1]。在这些家族中两个或两个以上的个体并发重复性葡萄胎妊娠。

　　二、微卫星序列多态性检测在完全性葡萄胎中的应用

　　微卫星序列多态性（polymorphisms of microsatellate）又名短串联重复序列(Short tandem repeat STR),它广泛分布于整个人体基因组中，平均每5～15kb出现一个。到目前为止，在人体基因组23对染色体中发现STR8000多种，其核心序列为2～6个碱基，通常重复15～30次，长度一般在400bp左右，人群中STR核心序列重复次数的不同就形成了丰富的群体多态性。STR是继RFLP(restriction fragment length polymorphism RFLP)的第二代的亲子鉴定技术,它比RFLP具有更高的多态性,比单个SNP(single nucleotide polymorphism SNP)信息量更丰富。STR具有以下优点：①灵敏度高 目前已可对仅为1pg的模板DNA进行扩增，1ng的DNA模板就足够有效扩增；②部分降解的DNA也可以用于检测；③STR分型简单可标准化；④STR各位点扩增条件相差不大，几个位点可同管扩增，省时、省料、高效，因而STR系统是目前最常见的DNA分析技术[7]。Alins等[8]用八个微卫星位点（D16S539,D7S820,D13S317,D5S818,CSF1PO,TPOX,TH01,vWA）来确定来自三个不同种族的200个人的基因类型中证明了其在区配率、亲权指数、排除率上具有很好的可靠性。Kato[9]和Kihara[10]等学者都用上述相同的八个微卫星位点分别来区分CHM（20例）和PHM（12例）、AnCHM 和BiCHM，后者在11例葡萄胎中发现BiCHM3例，AnCHM8例(单、双精各4例)。Fisher等[11 ]认为六个微卫星位点就足以用来检测葡萄胎的亲代来源。Promega公司认为本研究所采取的九个位点鉴别率在不同种族人群中至少大于99.85%。我们研究的50例完全性葡萄胎的父母亲是肯定的,且为同一地区同一民族，用上述九个位点来确定CHM的亲代来源是非常可靠。在50例CHM中发现单亲为43例，占CHM中的86%；其中孤雄单精35例，占AnCHM中的81.4%,孤雄双精8例，占AnCHM中的18.9%；双亲为7例，占CHM的14%，这一研究成果结果与文献报道基本相似[1  6]，另外在大样本CHM中筛选BiCHM国内外文献未见报道。综上所述，微卫星序列多态性检测是一种鉴别完全性葡萄胎亲代来源的简便、快速、可靠、高效的方法。

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